나노-중재 siRNA 유전자 입을 성인 Zebrafish 마음에
Summary
조건부 유전자 녹아웃 또는 효과적인 유전자-최저 성인 zebrafish 장기를 개발 하는 주요 도전 남아 있다. 여기 우리 보고 수행 나노 중재 siRNA 유전자-성인 zebrafish 마음에 입을, 성인 기관 zebrafish 및 다른 모형 유기 체 공부에 대 한 새로운 기능 손실 방법 제공에 대 한 프로토콜.
Abstract
포유류 심근 경색 후 심 혼을 회생 하는 매우 제한 된 용량을가지고. 다른 한편으로, 성인 zebrafish 정점 절제 또는 cryoinjury, 그것에 게 심장 재생 연구에 대 한 중요 한 모형 유기 체를 만드는 후 그것의 심 혼을 재생성 합니다. 그러나, 성인 기관에 대 한 손실의 기능 방법의 부족은 심장 재생을 기본 메커니즘에 대 한 통찰력을 제한 했다. 다른 배달 시스템을 통해 RNA 간섭 포유류 세포 및 모형 유기 체에서 유전자 침묵 시키기를 위한 강력한 도구입니다. 우리 이전 siRNA 캡슐화 된 나노 성공적으로 셀 입력 및 재생 성인 zebrafish 마음에 놀라운 유전자 특정 최저에서 결과 보고 있다. 여기, 우리는 재생 성인 zebrafish 마음에 dendrimer 중재 siRNA 전달 및 유전자 침묵에 대 한 간단한 빠르고 효율적인 프로토콜을 제시. 이 메서드 zebrafish 성인 기관에서 유전자 기능을 결정 하기 위한 다른 접근을 제공 하 고 뿐만 아니라 다른 모델 유기 체에 확장 될 수 있습니다.
Introduction
심근 경색은 세계1주위 엄청난 경제적 부담으로 이어지는 주요 건강 위협이 되었다. 성인 포유류 심장 재생성 하 고 거시적인 규모 손실된 cardiomyocytes 흉터 조직 및 후속 심장 마비의 형성으로 이어지는 부상 후 보충 되지 않습니다. 포유류, 달리는 제 브라는 주로 심장 상해, 조사 심장 재생 의 분자 메커니즘에 대 한 이상적인 모델 유기 체 그것을 만들기의 다른 유형 후에 강력한 심근 확산을 통해 심장 재생 2,3,,45,6,,78. 해독 생 메커니즘 기본 zebrafish 심장 재생 인간의 심장 재생9를 개선 하기 위해 새로운 치료 전략에 대 한 검색에 있는 연구의 흥미로운 지역입니다.
유전자 조작 방법 zebrafish에 사용할 수 있습니다. 개구리, 병아리, 그리고 zebrafish10,11,,1213포유류 외에 널리 사용 되는 morpholinos (MO) 이들에 의하여 이루어져 있다. 모 성인 zebrafish 지 느 러 미, 뇌, 그리고 망막14,15,16,17,,1819에 대상 유전자 발현의 효율적인 최저가 있다. 잠겨-핵 산 (LNA)는 내 생 유전자 표현의 zebrafish 태아 뿐만 아니라 성인 동물 장기20,,2122, 에 노크를 사용 하는 다른 인공 oligonucleotide 23 , 그러나 24. 성인 마음에 대 한 효과적인 손실의 기능 방법의 부족 장기 중생의 분자 메커니즘을 공부에 장애를 유지 하는. 현재, 작은 분자 억제제 또는 지배적인 부정적인 돌연변이의 유전자 변형 식에서 주로 사용 특정 유전자 또는 성인 zebrafish 심장 재생25,26에에서 그것의 기능을 공부 하는 통로의 기능을 차단 하 ,27. 그러나, 모든 유전자 또는 신호 통로 이러한 방법에 대 한 적용.
작은 방해 RNAs (siRNAs)는 널리 사용 포유류 세포에 모형 유기 체 뿐만 아니라 성인 장기의 배아 손실의 기능 분석에 대 한 동물에서 전 임상 연구 모델28,,2930 , 31 , 32. siRNAs 종양33,,3435 그리고 cardiomyocytes36,,3738,39 유전자 침묵을 효과적으로 사용 되었습니다 ,40 다른 배달 시스템을 통해. 최근, 우리 개발 효율적인 siRNA로 캡슐화 된 나노 유전자-침묵 여러 다른 나노 입자41,,4243를 사용 하 여 재생 성인 심장에 대 한 새로운 도구를 제공 하 성인 zebrafish 장기에서 유전자의 기능 연구입니다. 우리의 이전 연구41,,4243을 바탕으로, 여기에 우리가 현재 siRNA 유전자 f PAMAM 페그-r 9을 사용 하 여 재생 성인 zebrafish 마음에 입을 위한 단순, 실용적인, 하지만 강력한 프로토콜 dendrimers입니다. Aldh1a2 (알데하이드 효소 1, 가족 A2) 유전자 upregulated zebrafish 정점 절제 후 되었고 Aldh1a2 의 제거 차단 심장 재생44. 여기 우리가 나노 캡슐화 siRNA 주입 하 여 중재 유전자 때 려 눕 힘 효율성을 테스트 하는 예제로 aldh1a2 유전자를 가져가 라. 이 프로토콜은 성인 zebrafish 마음에 zebrafish 심장 절제, 나노 입자의 화학 합성 siRNA 캡슐화 된 나노 입자에 전달 방법에 대 한 절차를 포함합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish는 완전히 성인 심장5를 포함 하는 기관의 다양 한 재생 가능 하다. 유전자 변형 및 유전자 메서드는 zebrafish의 배아에서 유전자 기능을 연구 개발, 조사 zebrafish45,46에서 생성 하는 조건부 돌연변이 체 대립 유전자의 발굴 작업으로 아직도 직면 된다. 따라서, 유전자 변형 지배적인 부정적인 돌연변이 또는 작은 분자 억제제 자주 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 중요 한 의견에 대 한 박사 IC 브루스를 감사 하 고 원고를 읽고. 이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31430059, 31701272, 31730061, 81470399, 및 31521062), 아 스 트 라 아시아 및 신흥 시장 혁신적인 의학 및 초기 발달에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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