Nanopartikel-medierad siRNA nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat
Summary
Det är fortfarande en stor utmaning att utveckla villkorlig gen-knockout eller effektiva gene-knockdown i vuxen zebrafiskar organ. Här rapporterar vi ett protokoll för presterande nanopartikel-medierad siRNA-nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat, vilket ger en ny förlust-av-funktion-metod för att studera vuxna organ i zebrafiskar och andra modellorganismer.
Abstract
Däggdjur har en mycket begränsad förmåga att regenerera hjärtat efter hjärtinfarkt. Däremot, återskapar de vuxna zebrafiskar dess hjärta efter apex resektion eller cryoinjury, vilket gör det till ett viktigt modellerar organism för hjärtat regenerering studie. Avsaknaden av förlust-av-funktion metoder för vuxna organ har dock begränsat insikter om mekanismerna bakom hjärtat regenerering. RNA-interferens via olika leveranssystem är ett kraftfullt verktyg för tysta gener i däggdjursceller och modellorganismer. Vi har tidigare rapporterat att siRNA-inkapslat nanopartiklar framgångsrikt komma in i cellerna och resultera i en anmärkningsvärd gen-specifika knockdown i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat. Här presenterar vi en enkel, snabb och effektiv protokollet för dendrimer-medierad siRNA delivery och nedtystning i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat. Denna metod ger en alternativ metod för att bestämma gen funktioner i vuxna organ i zebrafiskar och kan utökas till andra modellorganismer samt.
Introduction
Hjärtinfarkt har blivit en större hälsorisk, leder till en enorm ekonomisk belastning runt om världen1. Vuxna däggdjur hjärtat inte att regenerera och fylla på förlorad hjärtmuskelcellerna i makroskopisk skala efter skadan, vilket leder till bildandet av ärrvävnad och efterföljande hjärtsvikt. Till skillnad från däggdjur är zebrafiskar kapabel att hjärtat regenerering, främst genom robust hjärtinfarkt spridning efter olika typer av hjärt-skada, vilket gör det en ideal modellerar organism för att undersöka hjärtat regenerering molekylära mekanismer 2,3,4,5,6,7,8. Dechiffrera de endogena mekanismerna är underliggande zebrafiskar hjärtat regenerering ett spännande område för forskning i sökandet efter nya terapeutiska strategier för att förbättra mänskliga hjärtat regenerering9.
Det finns genetisk manipulation metoder i zebrafiskar. Dessa består av morpholinos (MO) som används också allmänt i grodor, chick och däggdjur förutom i zebrafiskar10,11,12,13. MO har effektiv Nedslagning av målet genuttryck i vuxen zebrafiskar fin, hjärna och näthinna14,15,16,17,18,19. Låst-nucleic acid (LNA) är en annan konstgjord oligonukleotiden brukade slå ner endogena genernas uttryck inte bara i zebrafiskar embryon, utan också i vuxna djur organ20,21,22, 23 , 24. bristen på effektiva förlust-av-funktion metoder för vuxna hjärtan är dock fortfarande ett hinder i att studera molekylära mekanismer för orgel regenerering. På nuvarande, småmolekylär hämmare eller transgena uttrycket av dominant-negativ mutanter används främst för att blockera funktionen av en viss gen eller väg att studera dess funktion i vuxen zebrafiskar hjärtat regenerering25,26 ,27. Dock inte alla gener eller signalvägar som är tillämpliga för dessa metoder.
Små-störande RNAs (siRNAs) används allmänt för förlust-av-funktion analysen i däggdjursceller och embryon av modellorganismer, liksom vuxna organ för prekliniska studier på djur modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har använts effektivt att tysta gener i tumörer33,34,35 och hjärtmuskelceller36,37,38,39 ,40 via olika leveranssystem. Nyligen har utvecklat vi effektiva siRNA-inkapslat nanopartikel-nedtystning i regenererande vuxen hjärtat med flera olika nanopartiklar41,42,43, som tillhandahåller ett nytt verktyg för funktionella studier av gener i vuxen zebrafiskar organ. Baserat på våra tidigare studier41,42,43, presenterar här vi en enkel, praktisk, men ändå kraftfulla protokoll för siRNA nedtystning i regenererande vuxen zebrafiskar hjärtat med f-PAMAM-PEG-R9 tåååålamooooooood. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenas 1, familjemedlem A2) genen var uppreglerad efter zebrafiskar apex resektion och ablation av Aldh1a2 blockerade de kardiella regenerering44. Här tar vi aldh1a2 gen som exempel att testa gen knockdown effektivitet medieras av nanopartiklar-inkapslat siRNA injektion. Detta protokoll innehåller en procedur för zebrafiskar hjärtat resektion, kemisk syntes av nanopartiklar och en leveransmetod på siRNA-inkapslat nanopartiklar i vuxen zebrafiskar hjärta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafiskar är fullt kapabel att regenerera en mängd organ inklusive de vuxna hjärta5. Medan transgena och genetiska metoder är väl utvecklade för att studera gen funktioner i embryon av zebrafiskar, inför utredare fortfarande den skrämmande uppgiften att generera villkorlig muterade alleler i zebrafiskar45,46. Således, transgena dominant-negativ mutanter eller småmolekylär hämmare används ofta till adress gen funktioner i vux…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. IC Bruce för kritiska kommentarer och läsa manuskriptet. Detta arbete stöds av bidrag från National Natural Science Foundation Kina (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 och 31521062), AstraZeneca Asien, och framväxande marknaden innovativ medicin och tidiga utveckling.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
