Det er fortsat en stor udfordring at udvikle betinget af gen-knockout eller effektiv af gen-knockdown i voksen zebrafisk organer. Her rapporterer vi en protokol for udfører nanopartikel-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjertet, hvilket giver en ny tab af funktion metode til at studere voksen organer i zebrafisk og andre modelorganismer.
Pattedyr har en meget begrænset kapacitet til at regenerere hjertet efter myokardieinfarkt. På den anden side regenererer den voksne zebrafisk sit hjerte efter apex resektion eller cryoinjury, hvilket gør det en vigtig model organisme for hjertet regenerering undersøgelse. Manglen på tab af funktion metoder for voksne organer har imidlertid begrænset indsigt i de underliggende hjerte regenerering mekanismer. RNA-interferens via forskellige leveringssystemer er et kraftfuldt værktøj til silencing gener i pattedyrsceller og modelorganismer. Vi har tidligere rapporteret at siRNA-indkapslede nanopartikler med held angive celler og resultere i en bemærkelsesværdig gen-specifikke knockdown i regenererende voksen zebrafisk hjertet. Her præsenterer vi en enkel, hurtig og effektiv protokol for dendrimer-medieret siRNA levering og genhæmning regenererende voksen zebrafisk midt. Denne metode giver en alternativ metode til bestemmelse af genet funktioner i voksen organer i zebrafisk og kan udvides til at omfatte andre modelorganismer så godt.
Myokardieinfarkt er blevet en stor sundhedstrussel, fører til en enorm økonomisk byrde omkring verden1. Den voksne pattedyr hjerte undlader at regenerere og genopbygge den tabte cardiomyocytes på en makroskopisk skala efter den skade, hvilket fører til dannelsen af ar væv og efterfølgende hjertesvigt. I modsætning til pattedyr er zebrafisk i stand til at hjertet regenerering, primært gennem robust Myokardie spredning efter forskellige typer af hjerte skade, hvilket gør det en ideel model organisme for at undersøge de molekylære mekanismer af hjertet regenerering 2,3,4,5,6,7,8. Decifrere de endogene mekanismer er underliggende zebrafisk hjerte regenerering et spændende område for forskning i søgningen for nye terapeutiske strategier til at forbedre menneskers hjerte regenerering9.
Genetisk manipulation metoder er tilgængelige i zebrafisk. Disse består af morpholinos (MO), er også meget udbredt i frøer, kylling og pattedyr udover i zebrafisk10,11,12,13. MO har effektive knockdown af target genekspression i voksen zebrafisk fin, hjernen og nethinden14,15,16,17,18,19. Låst-nucleic acid (LNA) er en anden kunstig oligonukleotid bruges til at banke ned endogene genekspression i zebrafisk embryoner, men også i voksne dyrs organer20,21,22,, 23 , 24. dog manglen på effektive tab af funktion metoder for voksnes hjerter stadig en hindring i at studere de molekylære mekanismer af orgel regeneration. På nuværende, små-molekyle hæmmere eller transgene udtryk for dominerende-negative mutanter bruges primært til at blokere funktionen af et bestemt gen eller vej at undersøge dets funktion i voksen zebrafisk hjerte regenerering25,26 ,27. Dog ikke alle gener eller signaling veje er gældende for disse metoder.
Blander sig små RNA’er (siRNAs) er almindeligt anvendt til analysen af tab af funktion i pattedyrsceller og embryoner af modelorganismer samt voksne organer efter prækliniske undersøgelser i dyr modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har brugt effektivt til tavshed gener i tumorer33,34,35 og cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 via forskellige leveringssystemer. For nylig har udviklet vi effektive siRNA-indkapslede nanopartikel genhæmning i regenererende voksen hjertet ved hjælp af flere forskellige nanopartikler41,42,43, giver et nyt værktøj til funktionelle studier af gener i voksen zebrafisk organer. Baseret på vores tidligere undersøgelser41,42,43, her vil vi præsentere en enkel, praktisk, men kraftfuld protokol for siRNA genhæmning i regenererende voksen zebrafisk hjertet ved hjælp af f-PAMAM-PIND-R9 dendrimers. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenase 1, familiemedlem A2) gen var upregulated efter zebrafisk apex resektion og ablation af Aldh1a2 blokeret hjerte regenerering44. Her tager vi aldh1a2 genet som et eksempel at teste gen knockdown effektivitet medieret af nanopartikler-indkapslede siRNA injektion. Denne protokol indeholder en procedure for zebrafisk hjerte resektion, kemisk syntese af nanopartikler og en leveringsmetode på siRNA-indkapslede nanopartikler i voksen zebrafisk hjerte.
For zebrafisk er fuldt ud i stand til at regenerere en række organer, herunder voksen hjerte5. Mens transgene og genetiske metoder er veludviklet for at studere genet funktioner i embryoner fra zebrafisk, efterforskere stadig over for en skræmmende opgave at generere betinget mutante alleler i zebrafisk45,46. Således transgene dominerende-negative mutanter eller små-molekyle hæmmere bruges ofte til adresse genet funktioner i voksen ze…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Dr. IC Bruce for kritiske kommentarer og læsning af manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 og 31521062), AstraZeneca Asien og Emerging Market innovativ medicin og tidlige udvikling.
tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
sharp forcep | WPI | 14098 | |
iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |