Малоинвазивный перенос эмбрионов и Витрификация эмбрионов на оптимальном этапе развития эмбриона в кроличьей модели

Summary

Вспомогательные репродуктивные методы (ARTs) находятся в постоянной оценке для улучшения результатов и снижения связанных с этим рисков. В этой рукописи описывается минимально инвазивная процедура переноса эмбрионов с эффективным криоконсервативным протоколом, который позволяет использовать кроликов в качестве идеальной модели животных для воспроизводства человека.

Abstract

Вспомогательные репродуктивные методы (искусство), такие как экстракорпоральное развитие эмбриона или криоконсервация эмбрионов, влияют на естественные модели развития с перинатальными и послеродовых последствиями. Для обеспечения безвредности Арт-приложений необходимы исследования на животных моделях. Кроме того, в качестве последнего шага исследования в области развития эмбриона требуют оценки их способности к развитию здорового потомства на полную перспективу. Здесь, перенос эмбрионов в матку незаменим для выполнения любого эксперимента, связанного с искусством.

Кролик использовался как образцовый организм для изучения воспроизводства млекопитающих на протяжении более века. В дополнение к своей филогенетическое близости к человеческому виду и его небольшого размера и низкой стоимости обслуживания, он имеет важные репродуктивные характеристики, такие как индуцированная овуляция, Хронология раннего эмбрионального развития, похожая на человека, и короткая беременность которые позволяют нам легко изучить последствия применения Арт. Более того, искусство (например, интрациклический впрыск спермы, культура эмбриона или криоконсервация) применяется с подходящей эффективностью для этого вида.

Используя лапароскопическую технику переноса эмбрионов и протокол криоконсервации, представленный в этой статье, мы описываем 1) как перенести эмбрионы через легкую, минимально инвазивную технику и 2) эффективный протокол для долгосрочного хранения кролика эмбрионов, чтобы обеспечить гибкий материально-технический потенциал и возможность транспортировки образца. Результаты, полученные после переноса эмбрионов кролика на различных стадиях развития, указывают на то, что морула является идеальной стадией для восстановления и переноса эмбрионов кролика. Таким образом, требуется перенос эмбриона, оправдывающий хирургическую процедуру. Кроме того, кролик morulae успешно витрифицированных и лапароскопию переданы, доказывая эффективность описанных методов.

Introduction

С целью обхода человеческого бесплодия или улучшения распространения скота высокой генетической ценности и сохранения животных генетических ресурсов, набор методов коллективно называют вспомогательных репродуктивных технологий, таких как суперовуляции, в Экстракорпоральное оплодотворение, культура эмбриона или криоконсервация были разработаны^1,2. В настоящее время гормональное лечение дается, чтобы стимулировать яичники и производить большое количество антрального яичника фолликулов¹. Ооциты, собранные из этих фолликулов, могут созреть, оплодотворены и развиваться в пробирке , пока они не будут либо криоконсервированными, либо переданы суррогатным матерям³. Тем не менее, во время этих процедур, гаметы и зиготы подвергаются ряд нефизиологических процессов, которые могут потребовать адаптации эмбриона, чтобы выжить в этих условиях^4,5. Эта адаптация возможна из-за ранней пластичности эмбриона, что позволяет изменения эмбриона в экспрессии генов и программирования⁶. Однако, эти изменения могут влиять на последующие этапы развития эмбриона до совершеннолетия, и в настоящее время широко признается, что методы, сроки, криоконсервация процедуры или условия культуры показывают различные результаты на эмбрион судьбы^{7 , 8}. Таким образом, для выяснения конкретных индуцированных эффектов искусства, использование хорошо охарактеризовать животных моделей неизбежна.

Первое документально живое рождение в результате переноса эмбрионов млекопитающих состоялось в 1890⁹. Сегодня, эмбрион передачи (ET) для суррогатной женщины является решающим шагом в изучении Арт-индуцированных эффектов во время предимплантационной на последующих стадиях развития эмбриона¹⁰. Технологии ET зависят от размера и анатомической структуры каждого животного. В случае крупногабаритных моделей животных, было возможно выполнить ET путем транскерических нехирургических ET методов, но в меньших по размеру видов катетеризации шейки матки является более сложным и хирургические методы часто используются¹¹. Тем не менее, хирургическое ET может вызвать кровотечение, которое может нарушить имплантацию и развитие эмбриона, как кровь может вторгнуться в просвет матки, вызывая гибель эмбриона¹⁰. Трансцервические нехирургические et методы по-прежнему применяются в организме человека, бабуинов, крупного рогатого скота, свиней и мышей^{12,13,14,15,16,17}, но хирургические ETs все еще используются в таких видах, как козы, овцы или другие животные, которые представляют дополнительные трудности^{10,18,19,20,21}, таких как кролики (два независимых черв) или мышей (малый размер). Тем не менее, хирургические методы переноса, как правило, постепенно заменялись менее инвазивными методами. Эндоскопия использовалась для переноса эмбрионов, например, у кроликов, свиней и мелких жвачных животных^18,19,20. Эти малоинвазивные методы эндоскопии могут быть использованы для переноса эмбрионов в ампулу через инфундибулум, что имеет важное значение для кроликов и продемонстрировал благотворное влияние на некоторые виды²⁰. Это основано на важности правильного диалога между эмбрионом и матерью во время ранних стадий эмбриона в яйцепроток. Как упоминалось выше, реконструкция эмбриона, которая имеет место в кроликах во время миграции эмбриона через яйцепроток, имеет важное значение для достижения эмбрионов, способных имплантировать^22,23.

Более крупные животные модели, такие как бычий, интересны тем, что биохимические и преимплантационной функции аналогичны тем, в человеческом виде²⁴. Тем не менее, крупные животные являются слишком дорогими, чтобы использовать в предварительных испытаниях, и грызуны считаются идеальной моделью (76% модели организмов грызунов) для лабораторных исследований²⁵. Однако, модель кролика обеспечивает некоторые преимущества над грызунами в воспроизводственных изучениях, по мере того как некоторые воспроизводственные биологические процессы выставлены людьми более подобны в кроликах чем те в мышах. Человек и кролики представляют подобную хронологическую активацию эмбрионального генома, гастроляции и гемохальной плацентарной структуры. Кроме того, с помощью кроликов можно узнать точные сроки оплодотворения и стадии беременности из-за их индуцированной овуляции²⁵. Жизни кролика циклы короткие, завершив беременность в 31 дней и достижения полового созревания около 4-5 месяцев; животное легко справляется из-за его послушного и неагрессивного поведения, и его содержание очень экономично по сравнению с расходами более крупных животных. Кроме того, очень важно упомянуть, что кролики имеют дуплексную матку с двумя независимыми сервиксы^11,25. Это помещает кролика в преференциальное положение, по мере того как зародыши от по-разному экспериментально групп можно перенести в такое же животное, но в по-разному Рожочок матки. Это позволяет нам сравнивать как экспериментальные эффекты, уменьшая материнский фактор из результатов.

Сегодня, нехирургических ET методы не используются в кролике. Некоторые исследования, проведенные в конце 90-х годов с использованием трансцервикальной технологии et привели к низкой скорости доставки от 5,5% до 20,0%^11,26 против 50-65% хирургические методы, среди них процедура Лапароскопия описывается Безенфельдер и Брем¹⁸. Низкие показатели успешности этих нехирургических ET методов у кроликов совпадают с отсутствием необходимого ремоделирования эмбриона в яйцепроток, которого можно избежать в трансцервикальной ET. Здесь мы описываем эффективную минимально инвазивную лапароскопическую процедуру ET с использованием кроликов в качестве модельного организма. Этот метод обеспечивает модель для дальнейшего репродуктивного исследования в крупных животных и людей.

Потому что кролики имеют особенно узкое окно времени для имплантации эмбриона, ET в этом виде требует высокой степенью синхронности между стадии развития эмбриона в ET и физиологический статус получателя²⁷. В некоторых случаях, после репродуктивного лечения, что замедляет развитие эмбриона (например, в пробирке культуры) или изменяет Восприимчивость эндометрия (например, суперовуляции лечения), нет синхронности между эмбрионом и материнской матки. Эти ситуации могут негативно сказаться на результатах. Чтобы ответить в этих контекстах, мы описываем эффективный протокол витрификации кролика, который позволяет нам приостановить, организовать и возобновить эксперименты. Этот процесс является технически желательным для репродуктивных исследований и дает нам способность к долгосрочному хранению эмбрионов, позволяя их транспортировке. Лапароскопические процедуры и криоконсервация стратегии позволяют лучше планировать исследования с меньшим количеством животных. Таким образом, Наша методика предлагает гигиенические и экономические преимущества и соответствует концепции 3Rs (замена, сокращение и уточнение) исследований на животных с заявленной целью улучшения лечения человека подопытных животных. Таким образом, с помощью этих методов, кролики представляют собой идеальную модель организма для в естественных условиях репродуктивных анализов.

Protocol

Все экспериментальные процедуры, используемые в данном исследовании, были выполнены в соответствии с директиве 2010/63/EU ЕЭК для экспериментов на животных и рассмотрены и утверждены этическим Комитетом по экспериментам с животными в университете Politècnica де València, Испания (исследовательск…

Representative Results

Минимально инвазивная лапароскопическая передача свежих или витрифицированных эмбрионов помещает кролика в число лучших моделей животных для репродуктивных исследований. Таблица 1 показывает результаты свежего et на различных стадиях развития (рис.<strong class=…

Discussion

С первых документально живых случае рождения из переданных эмбрионов⁹, этот метод и кроликов видов стали решающими в репродуктивные исследования. Кроме того, исследования эмбриона, включающие манипуляции, производство, криоконсервацию и т.д. , требуют в качестве после…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	332
Buprenorphine hydrochloride	Alvet Escartí	626	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate	Sigma Aldrich	B3303
Clorhexidine digluconate soap	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution	Alvet Escartí	0265DCCA500B
CO2	Air Liquide	99921	CO2 N48.
CO2 Incubator	Fisher scientific	15385194
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Without calcium chloride.
Electric razor	Oster Golden A5	078005-140-002
Endoscope camera	Optomic Spain S.A	OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Lightweight trocar model.
Enrofloxacin	Alvet Escartí	9993046	To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G	Alvet Escartí	514056353	Smaller needles can be also used.
Epidural catheter	Vygon corporate	187.10
Epidural needle	Vygon corporate	187.10
Ethylene Glycol	Sigma Aldrich	102466-M
Eye ointment	Alvet Escartí	5273
Ketamine hydrochloride	Alvet Escartí	184	To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
Liquid Nitrogen	Air Liquide	P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Meloxicam	Alvet Escartí	9993501	To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm	Sigma Aldrich	CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan)	IBOR medica	7140028
Plastic Straw 0.25 mL	IMV – technologies	6431
Povidone iodide solution	Alvet Escartí	02656DPYS500S
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Stereomicroscope	Leica	MZ16F	There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves	Alvet Escartí	087GL010075
Sterile gown	Alvet Escartí	12261501
Sterile mask	Alvet Escartí	058B15924B
Straw Plug	IMV – technologies	6431
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Syringe, 1-mL	Fisher scientific	11750425
Syringe, 5-mL	Fisher scientific	11773313
Urinary catheter	IMV – technologies	17722
Waterbath	RAYPA	BAE-4
Xylazine	Alvet Escartí	525225	To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits	Universitat Politècnica de València	Line A	Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.