Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Summary

Die assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) werden kontinuierlich bewertet, um die Ergebnisse zu verbessern und die damit verbundenen Risiken zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt ein minimal-invasives Embryotransfer-Verfahren mit einem effizienten Kryokonservierungsprotokoll, das die Verwendung von Kaninchen als ideales Tiermodell der menschlichen Fortpflanzung ermöglicht.

Abstract

Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs), wie in der vitro-Embryonenkultur oder Embryonen-Kryokonservierung, beeinflussen natürliche Entwicklungsmuster mit perinatalen und postnatalen Folgen. Um die Unschuld von ART-Anwendungen zu gewährleisten, sind Studien in Tiermodellen notwendig. Darüber hinaus erfordern die Studien zur Embryonenentwicklung als letzten Schritt eine Bewertung ihrer Fähigkeit, einen vollzeitlichen gesunden Nachwuchs zu entwickeln. Hier ist der Embryotransfer in die Gebärmutter unverzichtbar, um alle ARTs-bezogenen Experimente durchzuführen.

Das Kaninchen wird seit mehr als einem Jahrhundert als Modellorganismus verwendet, um die Säugetierreproduktion zu untersuchen. Neben seiner phylogenetischen Nähe zur menschlichen Spezies und ihrer geringen Größe und geringen Wartungskosten hat sie wichtige reproduktive Eigenschaften wie induzierter Eisprung, eine Chronologie der frühen embryonalen Entwicklung, die dem Menschen ähnelt, und eine kurze Schwangerschaft. Damit können wir die Folgen der ART-Anwendung leicht untersuchen. Darüber hinaus werden bei dieser Art ARTs (wie intrazytoplasmatische Spermieninjektion, Embryonenkultur oder Kryokonservierung) mit entsprechender Effizienz angewendet.

Mit Hilfe der laparoskopischen Embryotransfer-Technik und des in diesem Artikel vorgestellten Kryokonservierungsprotokolls beschreiben wir 1) wie Embryonen durch eine einfache, minimal-invasive Technik übertragen werden können und 2) ein wirksames Protokoll für die langfristige Lagerung von Kaninchen Embryonen, die zeit-flexible Logistikkapazitäten und die Transportfähigkeit der Probe bieten. Die Ergebnisse, die nach der Übertragung von Kaninchenembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien erzielt wurden, deuten darauf hin, dass Morula die ideale Stufe für die Wiederherstellung und Übertragung von Kaninchenembryonen ist. Daher ist ein oviductaler Embryotransfer erforderlich, der den chirurgischen Eingriff rechtfertigt. Darüber hinaus werden Kaninchenmorulae erfolgreich verglast und laparoskopisch übertragen, was die Wirksamkeit der beschriebenen Techniken beweist.

Introduction

Mit dem Ziel, die menschliche Unfruchtbarkeit zu umgehen oder die Verbreitung von Nutztieren mit hohem genetischen Wert zu verbessern und die genetischen Ressourcen der Tiere zu erhalten, wird eine Reihe von Techniken, die gemeinhin als assistierte Fortpflanzungstechnologien bezeichnet werden, wie zum Beispiel Superovulation, in Die vitro-Fertilisation , die Embryonenkultur oder die Kryokonservierung wurden^1,2entwickelt. Derzeit werden hormonelle Behandlungen gegeben, um die Eierstöcke zu stimulieren und eine große Anzahl von antralen Eierstöcken follikeln¹. Oozyten, die aus diesen Follikeln gesammelt werden, können gereift, gedüngt und in vitro entwickelt werden, bis sie entweder kryokonserviert oder an Leihmütter übertragen werden³. Während dieser Behandlungen sind Gameten und Zygoten jedoch einer Reihe nicht-physiologischer Prozesse ausgesetzt, die eine Embryonenanpassung erfordern könnten, um unter diesen Bedingungen^4,5zu überleben. Diese Anpassung ist aufgrund der frühen Embryoplastizität möglich, die Embryonenveränderungen in der Genexpression und Entwicklungsprogrammierung⁶ermöglicht. Diese Änderungen können jedoch die nachfolgenden Stadien der Embryonenentwicklung bis ins Erwachsenenalter beeinflussen, und es ist inzwischen allgemein anerkannt, dass Methoden, Timing, Kryokonservierungsverfahren oder Kulturbedingungen unterschiedliche Ergebnisse über das EmbryonenSchicksal zeigen. ^{, 8}. Um die spezifischen induzierten Wirkungen von ARTs zu erklären, ist daher der Einsatz gut charakteristischer Tiermodelle unvermeidlich.

Die erste dokumentierte Lebengeburt, die durch die Übertragung von Säugetierembryonen resultierte, fand 1890^statt. Heute ist der Embryotransfer (ET) zu einem Leihmautat ein entscheidender Schritt bei der Untersuchung der ART-induzierten Effekte während der Preimenplantation auf den nachfolgenden Embryonalentwicklungsstufen 10. Die ET-Techniken hängen von der Größe und der anatomischen Struktur jedes Tieres ab. Bei großen Tiermodellen ist es möglich gewesen, ET durch transzervikale nichtchirurgische ET-Techniken durchzuführen, aber bei kleineren Arten ist Katheterisierung des Gebärmutterhalses komplexer und chirurgische Techniken werden häufig verwendet 11. Allerdings kann chirurgisches ET zu Blutungen führen, die die Implantation und die Embryonenentwicklung beeinträchtigen könnten, da Blut in das Gebärmutterlumen eindringen kann, was den Embryonentod 10 verursacht. Transcervical-nichtchirurgische ET-Techniken werden immer noch bei Menschen, Pavianen, Rindern, Schweinenund Mäuse 12, 13, 14, 15^,16,17 angewendet,^aberchirurgisch ETS wird immer noch in Arten wie Ziegen, Schafe oder andere Tiere, die zusätzliche Schwierigkeiten 10^,18, 19, 20^,21,wieKaninchen (zwei Unabhängige cervices) oder Mäuse (kleine Größe). Dennoch sind chirurgische Übertragungsmethoden in der Regel nach und nach durch weniger invasive Methoden ersetzt worden. Die Endoskopie wurde zur Übertragung von Embryonen eingesetzt, zum Beispiel bei Kaninchen, Schweinen und kleinenWiederkäuern 18,¹⁹,^20. Diese minimal-invasiven Endoskopie-Methoden können verwendet werden, um Embryonen über das Infundibulum in die Ampulla zu übertragen, das bei Kaninchen unverzichtbar ist und bei einigenArten 20 positive Wirkungen gezeigt hat. Dies beruht auf der Bedeutung des richtigen Dialogs zwischen Embryo und Mutter während der frühen Embryonenphase im oviduct. Wie bereits erwähnt, ist der Embryonenumzug, der bei Kaninchen während der Embryonenwanderung durch den oviduct^stattfindet, unerlässlich, um Embryonen zu erreichen, die in der Lage sind, 22^,23zu implantieren.

Größere Tiermodelle, wie Rinder, sind interessant, weil die Biochemie-und Präimplantationsmerkmale denen der menschlichen Spezies 24ähneln. Große Tiere sind jedoch zu teuer, um sie in Vorversuchen einzusetzen, und Nagetiere gelten als ideales Modell (76% Modellorganismen sind Nagetiere) für Laborforschung 25. Dennoch bietet das Kaninchenmodell einige Vorteile gegenüber Nagetieren in Fortpflanzungsstudien, da einige reproduktive biologische Prozesse, die von Menschen gezeigt werden, bei Kaninchen ähnlicher sind als bei Mäusen. Mensch und Kaninchen weisen eine ähnliche chronologische embryonale Genomaktivierung, Gastrulation und hemochronische Plazenta-Struktur auf. Darüber hinaus ist es möglich, mit Kaninchen den genauen Zeitpunkt der Befruchtung^undSchwangerschaftsstadien aufgrund ihres induzierten Eisprungs 25 zu kennen. Kaninchenlebenszyklen sind kurz, vollenden die Schwangerschaft in 31 Tagen und erreichen die Pubertät bei etwa 4-5 Monaten; Das Tier ist aufgrund seines gefügigen und nicht aggressiven Verhaltens leicht zu handhaben, und sein Unterhalt ist im Vergleich zu den Kosten größerer Tiere sehr sparsam. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass Kaninchen eine Duplex-Gebärmutter mit zwei^{unabhängigen}Gebärmutterhalskrebs^11,25haben. Dadurch wird das Kaninchen bevorzugt, da Embryonen aus den verschiedenen Versuchsgruppen in das gleiche Tier, aber in ein anderes Gebärmutterhorn übertragen werden können. So können wir beide experimentellen Effekte vergleichen und so den mütterlichen Faktor aus den Ergebnissen reduzieren.

Heute werden nicht-chirurgische ET-Methoden nicht mehr im Kaninchen eingesetzt. Einige Studien, die in den späten 90er Jahren mit einer Transcervical-ET-Technik durchgeführt wurden, führten zu niedrigen^Lieferraten von 5,5% bis 20,0%^11,26gegenüber 50-65% durch chirurgische Methoden, darunter die Laparoskopie-Verfahren, die von beschrieben wurden. Besenfelder und Brem¹⁸. Die geringen Erfolgsraten dieser nicht-chirurgischen ET-Methoden bei Kaninchen decken sich mit dem Fehlen der notwendigen Embryonenumgestaltung im oviduct, die in transscervical ET vermieden wird. Hier beschreiben wir ein effektives minimal-invasives laparoskopisches ET-Verfahren, bei dem Kaninchen als Modellorganismus eingesetzt werden. Diese Technik ist ein Modell für die weitere Fortpflanzungsforschung bei großen Tieren und Menschen.

Da Kaninchen ein besonders schmales Zeitfenster für die Embryonenimplantation haben, erfordert ET in dieser Art ein hohes Maß an Synchronisation zwischen dem Entwicklungsstadium des Embryos bei ET und dem physiologischen Statusdes Empfängers 27. In einigen Fällen gibt es nach einer reproduktiven Behandlung, die die Embryonenentwicklung verlangsamt (wie in der In-vitro-Kultur) oder die Endometriumempfänglichkeit (wie Superovulationsbehandlungen), keine Synchronisation zwischen dem Embryo und der mütterlichen Gebärmutter. Diese Situationen können sich negativ auf das Ergebnis auswirken. Um in diesen Zusammenhängen zu reagieren, beschreiben wir ein effektives Kaninchenmorula-Vervitungsprotokoll, das es uns ermöglicht, die Experimente zu unterbrechen, zu organisieren und wieder aufzunehmen. Dieser Prozess ist logistisch wünschenswert für Fortpflanzungsstudien und gibt uns die Möglichkeit, Embryonen langfristig zu lagern, so dass sie transportiert werden können. Die laparoskopischen Verfahren und Kryokonservierungsstrategien ermöglichen eine bessere Planung von Studien mit weniger Tieren. So bietet unsere Methodik hygienische und wirtschaftliche Vorteile und entspricht dem Konzept der 3R (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) der Tierforschung mit dem erklärten Ziel, die menschliche Behandlung von Versuchstieren zu verbessern. So stellen Kaninchen mit diesen Methoden einen idealen Modellorganismus für in vivo reproduktiven Assays dar.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren, die in dieser Studie angewendet werden, wurden gemäß der Richtlinie 2010/63/EU-EWG für Tierversuche durchgeführt und von der Ethikkommission für Experimente mit Tieren der Universität Politècnica de València überprüft und genehmigt, Spanien (Forschungscode: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC und JSV besitzen eine von der valencianischen Regierungsverwaltung ausgestellte Zulassungsbescheinigung, um an Tieren zu experimentieren. XGD ist ermächtigt, das Wohlergehen und die Pflege …

Representative Results

Minimal invasive laparoskopische Übertragung von frischen oder verglasten Embryonen zählt das Kaninchen zu den besten Modelltieren für Fortpflanzungsstudien. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von frischem ET in verschiedenen Entwicklungsstadien (Abbildung 4) übertragender Embryonen. Die Überlebensrate bei der Geburt (Prozentsatz der Embryonen, die zu einem Aufschlag führen) bewies die Wirksamkeit der laparoskopischen Technik, die in diesem…

Discussion

Seit dem ersten dokumentierten Lebendgeburtsfall^ausübertragenen Embryonen 9 sind diese Technik und die Kaninchenarten in Fortpflanzungsstudien entscheidend geworden. Darüber hinaus erfordern Embryonenforschungsstudien zu Manipulation, Produktion, Kryokonservierung usw . als letzten Schritt die Bewertung der Embryonenkapazität, um gesunde Vollzeitergebnisse zu erzeugen. Daher ist die Embryotransfer-Technik13,^{28unverzichtbar}. Im …

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	332
Buprenorphine hydrochloride	Alvet Escartí	626	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate	Sigma Aldrich	B3303
Clorhexidine digluconate soap	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution	Alvet Escartí	0265DCCA500B
CO2	Air Liquide	99921	CO2 N48.
CO2 Incubator	Fisher scientific	15385194
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Without calcium chloride.
Electric razor	Oster Golden A5	078005-140-002
Endoscope camera	Optomic Spain S.A	OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Lightweight trocar model.
Enrofloxacin	Alvet Escartí	9993046	To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G	Alvet Escartí	514056353	Smaller needles can be also used.
Epidural catheter	Vygon corporate	187.10
Epidural needle	Vygon corporate	187.10
Ethylene Glycol	Sigma Aldrich	102466-M
Eye ointment	Alvet Escartí	5273
Ketamine hydrochloride	Alvet Escartí	184	To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
Liquid Nitrogen	Air Liquide	P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Meloxicam	Alvet Escartí	9993501	To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm	Sigma Aldrich	CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan)	IBOR medica	7140028
Plastic Straw 0.25 mL	IMV – technologies	6431
Povidone iodide solution	Alvet Escartí	02656DPYS500S
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Stereomicroscope	Leica	MZ16F	There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves	Alvet Escartí	087GL010075
Sterile gown	Alvet Escartí	12261501
Sterile mask	Alvet Escartí	058B15924B
Straw Plug	IMV – technologies	6431
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Syringe, 1-mL	Fisher scientific	11750425
Syringe, 5-mL	Fisher scientific	11773313
Urinary catheter	IMV – technologies	17722
Waterbath	RAYPA	BAE-4
Xylazine	Alvet Escartí	525225	To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits	Universitat Politècnica de València	Line A	Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.