用线 Myography 测定小鼠肠系膜动脉的等轴收缩力
Summary
采用线 myograph 技术对血管平滑肌功能和筛查新药进行了研究。我们报告一个详细的协议, 以测量的等距收缩性的小鼠肠系膜动脉和筛选新的松弛剂血管平滑肌。
Abstract
线 myograph 技术是用来评估血管平滑肌收缩性的反应, 对退极化, GPCR 激动剂/抑制剂和药物.它广泛应用于血管平滑肌的生理功能、高血压等血管疾病的发病机制, 以及平滑肌松驰药物的发展。老鼠是一种广泛使用的模型动物, 有大量的疾病模型和基因改良菌株。本方法对小鼠肠系膜动脉的等距收缩进行了详细的测定。1.4 毫米的小鼠肠系膜血管阻力动脉被隔离, 并安装在一个 myograph 室通过通过两个钢丝通过其流明。在平衡和规范化步骤之后, 在收缩试验前两次用高钾+溶液增强容器段。作为该方法在药物开发中应用的一个例子, 我们测量了一种新的天然物质 neoliensinine 的松弛效应, 从中草药中分离出来的, 莲子的胚胎 (莲莲莲藕). 小鼠肠系膜上动脉。在 myograph 室安装的容器段受到高 K+溶液的刺激。当力张力达到稳定的持续阶段时, neoliensinine 的累积剂量增加到腔室。我们发现 neoliensinine 对平滑肌收缩有剂量依赖性的松弛作用, 因此表明它对高血压有潜在的活性。此外, 由于在高钾溶液的安装和维持收缩力的作用下, 血管段至少能存活4小时 , 我们建议 myograph 系统可用于药物筛选的耗时过程。
Introduction
这里使用的小容器 myograph 系统是用来测量直径从100到400µm 的小电阻容器的等距收缩. 隔离的小容器 (大约2毫米长) 被两个 40-µm 直径导线插入并且然后按顺序安装在千分尺端和换能器侧颚上。这 myograph 技术在1972年第一次被建议了, 然后主要由 Mulvany 和他的同事开发了2,3,4,5,6。它现在是一个成熟的技术与稳定的设备, 容易的性能和标准规范化程序7,8,9。我们利用这种方法对小鼠肠系膜动脉的测量进行了一些修改。
血管平滑肌线几乎所有血管的墙壁。它们的基本功能是通过收缩来产生力量来响应各种刺激。血管平滑肌的正常收缩力对血压调节和营养补充10至关重要。血压异常调节导致多种疾病, 包括高血压、心力衰竭和缺血.一些研究表明, 异常的血压总是与功能失调的血管平滑肌收缩7,11,12,13。myograph 方法允许研究各种刺激, 包括血管收缩剂, 抑制剂和药物诱发的小鼠血管的等距收缩力。成功的收缩测量将有助于我们了解血压维持机制和血管平滑肌相关疾病的发病机理, 并探讨新的治疗方法。
许多中草药已广泛用于血管疾病的临床治疗;然而, 它们的有效成分通常仍不得而知。因此, 有效成分的分离和鉴定对新药的开发具有重要意义。多线 myograph 技术为筛选草药中的活性成分提供了一种简单的方法。我们报告了几项研究使用小血管 myograph 系统来调查小鼠肠系膜动脉收缩和确定的天然化合物与抗高血压活动12,13,14。在这里, 我们描述了 myograph 方法的详细协议, 并评估了 neoliensinine 从莲子的胚胎中分离出的松弛效应 (莲莲藕)。14。
Protocol
Representative Results
Discussion
高血压是一个广泛的公共卫生挑战, 由于其严重并发症, 包括心血管和肾脏疾病16。了解高血压发病机制, 探索更多抗高血压药物已成为该领域的一项紧迫任务。血压是由循环的外周阻力产生和维持的。根据泊肃叶定律, 相对较小的动脉产生很大比例的循环阻力, 并作为主导的血压3,10的生产者。因此, 测量小阻力动脉而不是大动脉更适合?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢魏琪博士 (苏州大学, 苏州市, 中国) 和闫宁桥 (陕西师范大学, 西安, 中国) 的技术援助。这项工作得到了中国国家自然科学基金 (赠款31272311、81373295和 81473420) 的支持, 并由江苏省高等教育机构优先学术项目开发资助的项目 (批准号:ysxk-2016)。
Materials
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. . Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. . Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochimie. 5 (2), 467-477 (1966).
