Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar
Summary
Ledning myograph teknik bruges til at undersøge vaskulære glatte muskelceller funktioner og skærmen nye lægemidler. Vi rapporterer en detaljeret protokol til måling af de isometriske kontraktilitet af musen mesenterica arterie og til screening af nye afslapning af vaskulær glat muskulatur.
Abstract
Ledning myograph teknik bruges til at vurdere kontraktilitet af vaskulære glatte muskler som svar på depolarization, GPCR agonister/hæmmere og narkotika. Det er almindeligt anvendt i mange undersøgelser af de fysiologiske funktioner af vaskulære glatte muskelceller, patogenesen af Vaskulære sygdomme som forhøjet blodtryk og udviklingen af glatte muskelceller muskelafslappende medicin. Musen er en meget anvendt model dyr med en stor pulje af sygdomsmodeller og genetisk modificerede stammer. Vi introducerede denne metode til at måle isometrisk sammentrækning af musen mesenterica arterie i detaljer. En 1,4-mm segment af musen mesenteriallymfeknuderne modstand arterie blev isoleret og monteret på en myograph afdeling af passerer to stål ledninger gennem sin lumen. Efter ækvilibrering og normalisering foranstaltninger, blev fartøjet segment forstærkede af high-K+ løsning to gange før sammentrækning assay. Som et eksempel på anvendelsen af denne metode i udvikling af lægemidler målte vi den muskelafslappende virkning af en roman naturligt stof, neoliensinine, isoleret fra en kinesisk urt, embryoner af lotus frø (Nelumbo nucifera Gaertn.) på mus mesenteriallymfeknuderne arterier. Fartøj segmenter monteret på myograph afdeling blev stimuleret med en høj-K+ løsning. Når force spændingen nået en stabil vedvarende fase, blev kumulative doser af neoliensinine føjet til salen. Vi fandt, at neoliensinine havde en dosisafhængig muskelafslappende virkning på glat muskelsammentrækning, hvilket tyder på, at det bærer potentielle aktivitet mod forhøjet blodtryk. Derudover som fartøj segment kan overleve i mindst 4 timer efter montering og vedligehold kontraktilitet induceret af high-K+ løsning for mange gange, vi foreslår, at kan wire myograph system anvendes til den tidskrævende proces med stof screening.
Introduction
Det lille fartøj myograph system bruges her var til måling af isometrisk sammentrækning af lille modstand fartøjer med indre diameter spænder fra 100 til 400 µm. isolerede små fartøjer (omkring 2 mm lang) blev indsat af to 40-µm diameter ledninger og blev derefter monteret på mikrometer-side og transducer kæberne sekventielt. Denne myograph teknik blev først foreslået i 19721 og derefter udviklet primært af Mulvany og hans kolleger2,3,4,5,6. Det er nu en moden teknik med staldudstyr, let ydeevne og en standard normalisering procedure7,8,9. Vi udnyttede denne metode med nogle ændringer til målinger i mus mesenterica arterie.
Vaskulære glatte muskelceller linjer væggene i næsten alle blodkar. Deres grundlæggende funktion er at generere styrker gennem sammentrækning i respons på forskellige stimuli. Den normale kontraktilitet af vaskulære glatte muskulatur er vigtigt for blodtryk forordning og ernæring supplement til10. Unormal regulering af blodtrykket resulterer i en lang række sygdomme, herunder hypertension, hjerteinsufficiens og blandt. Flere undersøgelser har antydet, at unormale blodtryk er altid forbundet med dysfunktionelle vaskulære glatte muskelceller kontraktilitet7,11,12,13. Metoden myograph tillader undersøgelse af isometrisk kontraktilitet af musen fartøjer induceret af forskellige stimuli herunder vasoconstrictors, hæmmere og narkotika. Vellykket målinger af sammentrækning vil hjælpe os med at forstå mekanismerne af blodtryk vedligeholdelse og patogenese af vaskulær glat muskulatur-associerede sygdomme og til at udforske nye terapeutiske tilgange.
Mange kinesiske urter har været udbredt for klinisk behandling af Vaskulære sygdomme; men deres effektive ingredienser normalt forbliver ukendt. Således, isolering og identifikation af de effektive komponenter er meget vigtigt for udviklingen af nye lægemidler. Multi wire myograph teknologi tilbyder en enkel tilgang til screening af aktive komponenter i urter. Vi har rapporteret adskillige undersøgelser ved hjælp af lille skib myograph system til at undersøge mus mesenterica arterie sammentrækning og identificeret naturlige forbindelser med anti-hypertension aktivitet12,13,14. Her beskriver vi de detaljerede protokol for metoden myograph og vurdere den muskelafslappende virkning af neoliensinine isoleret fra embryoner af lotus frø (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hypertension er en udbredt offentlig sundhedsudfordring på grund af sin alvorlige komplikationer, herunder hjerte-kar- og nyre sygdomme16. Forståelse patogenesen af hypertension og udforske mere anti-hypertensive stoffer er blevet en presserende opgave i dette felt. Blodtryk er genereres og vedligeholdes af perifere modstand af cirkulation. Ifølge Poiseuilles lov, de relativt små arterier genererer en stor del af kredsløbssygdomme modstand og tjene som den dominerende producent af blodtryk<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Wei Qi He (Soochow Universitet, Suzhou, Kina) og Dr. Yan Ning Qiao (Shaanxi Normal University, Xi’an, Kina) for den tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af den National Natural Science Foundation of China (Grant 31272311, 81373295 og 81473420) og projektet finansieret af de prioriterede akademiske Program udvikling af Jiangsu højere læreanstalter (Grant nr. ysxk-2016).
Materials
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. . Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. . Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochimie. 5 (2), 467-477 (1966).
