Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía
Summary
La técnica del miógrafo de alambre se utiliza para investigar las funciones del músculo liso vascular y nuevos fármacos de la pantalla. Se presenta un protocolo detallado para medir la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón y para la detección de nuevos relajantes del músculo liso vascular.
Abstract
La técnica de laringe de alambre se utiliza para evaluar la contractilidad de los músculos lisos vasculares en respuesta a la despolarización, agonistas/inhibidores de GPCR y drogas. Es ampliamente utilizado en muchos estudios sobre las funciones fisiológicas del músculo liso vascular, la patogenesia de enfermedades vasculares como la hipertensión y el desarrollo de drogas relajantes del músculo liso. El ratón es un animal modelo ampliamente utilizado con un gran número de modelos de la enfermedad y las cepas genéticamente modificadas. Se introdujo este método para medir la contracción isométrica de arteria mesentérica ratón en detalle. Un segmento de 1,4 mm de ratón resistencia mesentérica arteria fue aislado y montado en una cámara de laringe por pasar dos cables de acero a través de su luz. Después de conseguir el equilibrio y normalización de pasos, el segmento de buques era potenciado por una solución high-K+ dos veces antes del ensayo de contracción. Como ejemplo de la aplicación de este método en el desarrollo de fármacos, medimos el efecto relajante de una nueva sustancia natural, neoliensinine, aislado de una hierba China, embriones de la semilla de loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) en el ratón mesentérico arterias. Los segmentos de buque montados en la cámara de la laringe fueron estimulados con una solución de alto-K+ . Cuando la tensión de fuerza alcanza una fase sostenida estable, dosis acumulativas de neoliensinine fueron agregados a la cámara. Se encontró que neoliensinine tenía un efecto relajante del dependiente de la dosis en la contracción del músculo liso, así sugiriendo que tiene actividad potencial contra la hipertensión. Además, que el segmento vascular puede sobrevivir al menos 4 horas después del montaje y mantener la contractilidad inducida por la solución high-K+ para muchas veces, nos sugieren que el sistema del miógrafo de alambre puede utilizarse para el proceso desperdiciador de tiempo de la detección de drogas.
Introduction
El sistema de vasos miógrafo utilizado aquí fue para medir la contracción isométrica de los vasos de resistencia pequeña con diámetros interiores que van desde 100 hasta 400 μm. aislados los vasos pequeños (de unos 2 mm) se inserta por dos cables de 40 μm de diámetro y estaban entonces montado en las mordazas del micrómetro y transductor secuencialmente. Esta técnica de laringe fue primero sugerida en 19721 y entonces desarrollada principalmente por Mulvany y sus colegas2,3,4,5,6. Es una técnica madura con equipamiento, fácil funcionamiento y un procedimiento de normalización estándar7,8,9. Utilizamos este método con algunas modificaciones para la medición en la arteria mesentérica de ratón.
Músculo liso vascular recubre las paredes de casi todos los vasos sanguíneos. Su función fundamental es generar fuerzas a través de la contracción en respuesta a diversos estímulos. La contractilidad normal del músculo liso vascular es esencial para la regulación de la presión arterial y nutrición suplemento10. Regulación anormal de la presión arterial resulta en una variedad de enfermedades, como hipertensión, insuficiencia cardíaca y la isquemia. Varios estudios han sugerido que la presión de sangre anormal siempre es asociada con el músculo liso vascular disfuncional contractilidad7,11,12,13. El método de laringe permite investigación de contractilidad isométrica de los vasos del ratón inducida por varios estímulos, incluyendo drogas, inhibidores y vasoconstrictores. Medidas exitosas de contracción nos ayudará a comprender los mecanismos de mantenimiento de la hipertensión y la patogenesia de enfermedades asociadas de músculo liso vasculares y explorar nuevos enfoques terapéuticos.
Muchas hierbas chinas se han utilizado ampliamente para el tratamiento clínico de enfermedades vasculares; sin embargo, sus ingredientes eficaces generalmente siguen siendo desconocidos. Así, el aislamiento y la identificación de los componentes eficaces es muy importante para el desarrollo de nuevos fármacos. Tecnología multifilar miógrafo ofrece un enfoque simple para la detección de componentes activos en hierbas. Hemos divulgado varios estudios utilizando el sistema de laringe vasos para investigar la contracción de la arteria mesentérica de ratón e identificar compuestos naturales con actividad anti-hipertensión12,13,14. Aquí, describimos los detalles del protocolo para el método de la laringe y evaluar el efecto relajante de neoliensinine aislado de embriones de semilla de loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
La hipertensión es un reto de salud pública generalizado debido a sus graves complicaciones, incluyendo la cardiovascular y renal enfermedades16. Comprensión de la patogenesia de la hipertensión arterial y explorar más los medicamentos antihipertensivos se ha convertido en una tarea urgente en este campo. La presión arterial es generada y mantenida por la resistencia periférica de la circulación. Conforme a la ley de Poiseuille, las relativamente pequeñas arterias generan una gran proporc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Wei Qi He (Universidad de Suzhou, Suzhou, China) y el Dr. Yan Ning Qiao (Universidad Normal de Shaanxi, Xi ‘ an, China) para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant 31272311, 81373295 y 81473420) y el proyecto financiado por la prioridad académica programa de desarrollo de Jiangsu instituciones de educación superior (Grant no. ysxk-2016).
Materials
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. . Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. . Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochimie. 5 (2), 467-477 (1966).
