높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

Summary

여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

식별 하는 새로운 약물의 수에 의해 전통, 생체 외에서 스크린 쇠퇴 하고있다, 여러 약물 저항에 대처 하기 위해 새로운 무기에 대 한 검색에이 접근의 성공을 감소. 이 연구원은 새로운 약물을 찾는 데만 필요 하지 않습니다 하지만 또한 그들을 찾는 새로운 방법을 개발 해야 결론을 주도하 고 있다. 가장 유망한 후보자 사이 메서드는 전체 유기 체, vivo에서 분석 실험을 사용 하 여 높은 처리량, phenotypic 판독 Danio rerio 꼬마 선 충 에서 그 범위를 호스팅합니다. 이러한 호스트는 호스트 또는 biounavailable 독성 화합물을 일반적으로 비용이 많이 드는 따라 하기 전에 초기 화면에서 삭제 됩니다 거짓 긍정적인 안타에서 극적인 절감 등 여러 가지 강력한 이점이 있다.

여기에 우리가 어떻게 우리의 분석 결과 문서화 C. 선 충에서 호스트 변화를 심문 하는 데 사용 되었습니다 표시-녹 농 균 죽이 액체 pathosystem. 우리는 또한 잘 밖으로 일이 기술의 몇 가지 확장을 보여 줍니다. 예, 우리이 호스트 병원 체 상호 작용에서 쿼리 호스트 요인 플레이트 형식 높은 처리량 유전 스크린 24 또는 96 잘 RNAi를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 불과 몇 개월만에, 극적으로 힘 드는 생물 정화 방법에 대 한 필요 없이 잠재적으로 약물 표적을 식별 하는 작업을 단순화 수 있는 전체 게놈 스크린을 완료할 수 있습니다.

우리 또한 그람 양성 박테리아 Enterococcus faecalis 그람 음성 병원 체 피 녹 농 균에 대 한 대체 하는 우리의 방법의 변형 여기 보고 합니다. 많은 경우 처럼 피 녹 농 균에 대 한, E. faecalis 에 의해 죽이 시간 종속적입니다. 이전 선 충 C.달리-E. faecalis 분석 실험, 우리의 분석 결과 E. faecalis 팬 들은 preinfection의 정보 필요로 하지 않습니다, 그것의 안전 단면도 개선 및 액체 처리 장비를 오염 하는의 가능성을 감소. 분석 결과 매우 강력 하 고, ~ 95% 사망률 96 h 포스트 감염을 보여주는.

Introduction

식별 및 효과적인, 넓 스펙트럼 항생제의 개발 지금 거의 한 세기 전, 공중 보건에 분수령에 지도 되었다 대폭적인 신념 그 전염 성 질병 과거의 채찍 질 될 것 이라고. 짧은 몇 십년 내이 낙관론 병원 체 병원 체 개발이 한번 기적 치료 제한 저항 메커니즘 후로 지 러 지기 시작 했다. 몇 시간 동안, 약 발견 노력와 병원 체 사이 군비 경쟁 균형 잡힌 듯. 그러나, 항균의 오용은 최근 불러 팬-약물 내성 변종의 Klebsiella 균, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens및 피 농 균^{1의 출현 2,,34}.

P. 녹 농 균 은 편의적, 그램 네거티브, 멀티 호스트 병원 체 사람 immunocompromised, 또는 낭 성 섬유 증가지고 심한 화상 환자에 게 심각한 위협입니다. 그것은 또한 점점 더 심한 병원내 감염, 특히 항균 성 저항의 지속적인 인수 때문에 원인이 되는 대리인으로 식별 됩니다. 이 위협을 해결 하기 위해 시작, 우리는 문서화 C. 선 충–P. 녹 농 균 감염 시스템⁵를 사용 했습니다. 연구소는 호스트⁶죽 일 하는 병원 체의 기능을 제한 하는 새로운 화합물을 식별 하는 액체-기반, 높은 처리량, 높은 콘텐츠 심사 플랫폼을 개발 하는 것이 시스템을 활용 했다. 글에,이 화합물 제⁷ 과 독성 억제제⁸을 포함 하 여 적어도 3 개의 일반적인 범주에 속하는 것 같다. C. 선 충 에서 다른 높은 콘텐츠 약물 발견 분석 진 균 tuberculosum, 클 라 미디 아 속 trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, 황색 포도상구균, 칸디 다 albicans, 보고 되었습니다 및 Enterococcus faecalis, 다른 사람의 사이에서^{9,10,11,12,13,14,,1516}. 분석 실험의이 유형은 몇 가지 잘 인식된 장점이, 호스트와 병원 체, 화학 스크린과 넘어 안타를 식별 하는 기능에 비해 생체 이용률의 증가 가능성에 독성이 있을 수 있습니다 거짓 긍정적인 조회 수 제한 등 단순히 안티-virulents, 면역 물질로 분자, 또는 그렇지 않으면 전 찬성 호스트 병원 체 상호 작용의 균형을 기울일 화합물 등 미생물 성장을 제한. 또한,이 화면에서 발견 된 화합물은 종종 포유류 호스트에 효과적입니다.

그것은 적어도 두 개의 다른 분석 실험^17,18 액체에서 C. 선 충 에서 높은 처리량 화면 수행 수 있습니다 지적 가치가 있다. 그러나,이 분석 실험은 원형 장 식민지 분석 결과, 액체에서 느린-살인로 알려진 있도록 수정 처리량을 증가 하 고 더 쉽게 상영 하는 화합물을 수 있도록. 주의 특성화는 결정적으로 세균 독성의 기계 장치는 이러한 분석 및 우리의 액체 기반의 화면⁷사이 설명 했다. 이후 두 가지 유형의 독성 포유류 시스템에서 관찰 된다, 그것은 어떤 독성 결정은 분석 결과 선택 이전 실험의 관심사에 대 한 가장 관련성이 높은 고려 하는 것이 중요.

여기 우리가 액체 기반으로 최적화 된 버전을 보여 농 균 선 충-P. C. 분석 결과. 우리는 또한 그람 양성 세균성 병원 체에 맞게 우리의 액체 기반의 분석 방법의 적응을 보고 Enterococcus faecalis. P. 녹 농 균, 같은 E. faecalis 점점 항균 성 저항 경로¹의 성장 군비와 심각한 병원내 위협으로 식별 됩니다. E. faecalis 의 높은 처리량 검열에 대 한 이전 방법¹⁴존재, preinfection는 절차 복잡 하 고 COPAS FlowSort 같은 장비를 오염 하는 가능성을 증가 병원 체와 함께 필요 합니다. 우리의 프로토콜 안전 프로필 개선 사전 감염에 대 한 필요가 없다. 마지막으로, 우리는 이러한 분석 중 결합 될 수 있다 먹이의 설립에 있는 역할을 할 호스트 요소에 대 한 검색 사용자 수 있도록 RNAi 또는 감염에 저항 하는 수단을 보고 합니다.

Protocol

주의: 피 녹 농 균 과 E. faecalis 는 Biosafety 수준 2 병원 체, 그리고 우연한 감염을 방지 하 고 표면 오염 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치는가지고 야 한다. 모든 미디어 자료와 병원 균에 접촉 해야 합니다 수 소독 및/또는 삭제. 추가 지침 CDC 간행물 Biosafety Microbiological 및 생물 의학 실험실 (BMBL), 5 판에서에서 사용할 수 있습니다. 1. 준비 및 피 녹 농 균 의 ?…

Representative Results

분석 결과 성능에 대 한 중요 한 매개 변수 이 분석 결과 기본 생물학에 대 한 적절 한 이해는 문제 해결 및 분석 결과 최적화 필요 합니다. 이 위해, 우리 몇 가지 주요 논문 elucidating P. 녹 농 균의 pathogenesis의 메커니즘에 먼저 참조-죽이 액체7,20중재. 위에서 설명 하는 ?…

Discussion

이 분석 결과 (또는 다른 병원 체 피 농 균 또는 E. faecalis대체 됩니다 유사한 분석 실험)는 다양 한 약물 발견을 포함 하 여 목적에 대 한 유용 합니다. 그것은 또한 독성 요인, 호스트 방어 통로의 설명을 식별 하 고 호스트 병원 체 상호 작용에 관련 된 규제 기계를 확인 하 여 근본적인 생물학 질문을 해결 하는 데 유용.

P. 농 균 액체 죽이 분석 결과 강력한,…

Materials

COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5	BioTek
EL406 Washer Dispenser	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Deep-Well RB Block	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384-Well plate	Greiner Bio-One	MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM)			Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates			Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media			Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB)	USBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
Worm Bleach Solution			Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal			Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
Phospate buffer			amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution	BICCA	7495.5-32
NaOH solution	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	Diversified Biotech	BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Fisher Scientific	S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)