Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème
Summary
Nous décrivons ici un protocole qui est un hôte adaptable, entier, outil de dépistage de la forte teneur qui peut être utilisé pour étudier les interactions hôte-pathogène et être utilisé pour la découverte de médicaments.
Abstract
Le nombre de nouveaux médicaments identifiés par traditionnel, en vitro écrans a diminué, réduisant le succès de cette approche dans la recherche de nouvelles armes lutter contre la pharmacorésistance multiple. Cela a conduit à la conclusion que les chercheurs ne sont pas seulement la nécessité de trouver de nouveaux médicaments, mais aussi besoin de développer de nouvelles façons de les trouver. Parmi les candidats prometteurs, les méthodes sont tout micro-organisme, in vivo , essais qu’affichages utilisation de haut-débit, phénotypiques et héberge qui vont de Caenorhabditis elegans à Danio rerio. Ces hôtes ont plusieurs avantages puissants, y compris des réductions spectaculaires de fausses positifs hits, comme les composés qui sont toxiques pour l’hôte et/ou biounavailable sont généralement supprimées dans l’écran initial, avant de suivre coûteux vers le haut.
Ici, nous montrons comment notre essai a été utilisée pour interroger la variation d’hôte dans bien documenté c. elegans— pathosystème liquide meurtre dePseudomonas aeruginosa . Nous démontrons également plusieurs extensions de cette technique bien travaillée dehors. Par exemple, nous sommes en mesure de réaliser des écrans génétiques haut-débit à l’aide d’Arni dans 24 ou 96 puits formats de plaque aux facteurs de l’hôte requête dans cette interaction hôte-pathogène. À l’aide de ce test, étude globale du génome entier peut être complété en seulement quelques mois, ce qui peuvent considérablement simplifier la tâche d’identifier des cibles thérapeutiques, potentiellement sans la nécessité d’approches de purification biochimiques laborieux.
Nous rapportons également une variante de notre méthode qui substitue la bactérie Gram-positive Enterococcus faecalis pour le pathogène Gram négatif de P. aeruginosa. Beaucoup comme c’est le cas pour P. aeruginosa, assassinat par E. faecalis est fonction du temps. Contrairement à la précédente c. elegans— essaisd’e. faecalis , notre essai pour E. faecalis ne nécessite pas de preinfection, améliorer son profil d’innocuité et réduisant les risques de contamination de manutention des liquides. L’essai est très robuste, montrant ~ 95 % taux de mortalité 96 h après l’infection.
Introduction
L’identification et le développement d’antibiotiques efficaces, à large spectre, maintenant il y a près d’un siècle a conduit à un moment décisif dans la santé publique où il y avait une croyance largement répandue qu’infectieuse maladie serait un fléau du passé. Quelques courtes décennies, cet optimisme commença à décliner, comme pathogène après que pathogène mis au point des mécanismes de résistance qui limite ces traitements une fois miraculeuses. Depuis un certain temps, la course aux armements entre les efforts de découverte de drogue et les agents pathogènes semblait équilibrée. Toutefois, la mauvaise utilisation des antimicrobiens a récemment abouti à l’émergence de souches résistantes aux médicaments-pan de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescenset P. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa est un, gram négatif, multi-accueil agent pathogène opportuniste qui constitue une menace grave pour les patients atteints de brûlures graves, ceux qui sont immunodéprimés, ou souffrent de fibrose kystique. Il est également de plus en plus identifié comme un agent causal dans les infections nosocomiales graves, notamment en raison de son acquisition en cours de la résistance antimicrobienne. Pour commencer à faire face à cette menace, nous avons utilisé le bien documenté c. elegans–P. aeruginosa infection système5. Notre laboratoire a mis à profit ce système afin de développer une plate-forme de base liquide, haut débit, haute teneur de dépistage pour identifier de nouveaux composés qui limitent la capacité de l’agent pathogène de tuer l’ hôte6. Curieusement, ces composés semblent appartenir au moins trois catégories général, y compris les antimicrobiens7 et virulence inhibiteurs8. Autres essais de découverte de drogue forte teneur chez c. elegans ont été rapportés pour Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, et Enterococcus faecalis, entre autres,9,10,11,12,13,14,15,16. Ces types d’analyses ont plusieurs avantages reconnus, comme limiter la fausses hits positifs qui peuvent être toxiques à la fois l’hôte et l’agent pathogène, la probabilité de biodisponibilité par rapport à un écran chimique et la capacité d’identifier les visites au-delà tout simplement limiter la croissance microbienne, comme anti-virulents, des molécules stimulants immunitaires ou des composés qui autrement faire pencher la balance de l’interaction hôte-pathogène, en faveur de l’ancien. En outre, les composés découverts dans ces écrans sont souvent efficaces chez les hôtes mammifères.
Il est à noter qu’il existe au moins deux autres essais17,18 réaliser des écrans de haut-débit chez c. elegans en liquide. Cependant, chacun de ces tests est une modification qui permet le dosage la colonisation de l’intestin prototypique, connu comme lent-assassinat, à effectuer dans un liquide, augmentant le débit et permettant aux composés à subir plus facilement. Attention la caractérisation a démontré avec certitude que les mécanismes de la virulence bactérienne sont différents entre ces tests et notre base liquide Ecran7. Étant donné que les deux types de virulence sont observés dans les systèmes mammaliens, il est important d’examiner quels déterminants de virulence est le plus pertinent pour les intérêts de l’expérimentateur avant la sélection du dosage.
Nous démontrons une version optimisée de la base liquide dosage c. elegans-P. aeruginosa . Nous rapportons également l’adaptation de notre méthode de dosage de base liquide pour accueillir la bactérie pathogène Gram positive Enterococcus faecalis. Comme P. aeruginosa, E. faecalis est plus en plus identifiée comme une menace de graves infections nosocomiales avec un armement croissant de la résistance aux antimicrobiens voies1. Bien que14il existe une méthode précédente pour le criblage à haut débit d’e. faecalis , requiere preinfection avec l’agent pathogène, ce qui complique la procédure et augmente la probabilité de contamination des équipements tels que le FlowSort COPAS. Notre protocole élimine le besoin de préalable à l’infection, améliorer le profil d’innocuité. Enfin, nous présentons un moyen par lequel ou l’autre de ces tests peuvent être combinés avec alimentation Arni, permettant à l’utilisateur de rechercher des facteurs de l’hôte qui jouent un rôle dans la mise en place de, ou résistance à l’infection.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce dosage (ou essais similaires où les autres pathogènes sont substituées pour P. aeruginosa ou E. faecalis) est utiles pour diverses fins, notamment la découverte de médicaments. Il est également utile pour traiter des questions biologiques fondamentales, telles que les facteurs de virulence, l’élucidation des voies de défense hôte et la détermination du mécanisme réglementaire impliqués dans l’interaction hôte-pathogène.
Bien que l’essai P. aerugino…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la prévention du Cancer et le Research Institute of Texas (CPRIT) prix RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 et par le National instituts de santé K22 AI110552 attribué à NVK. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
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