En hög genomströmning, hög-innehåll, vätskebaserade C. elegans Pathosystem
Summary
Här beskriver vi ett protokoll som är en anpassningsbar, hela värd, hög-innehåll screeningverktyg som kan utnyttjas för att studera värd-patogen interaktioner och användas för läkemedelsutveckling.
Abstract
Antalet nya läkemedel som identifierats av traditionella, in vitro- skärmar har avtagit, minska framgången av detta tillvägagångssätt i sökandet efter nya vapen att bekämpa flera läkemedelsresistens. Detta har lett till slutsatsen att forskare inte bara behovet av att hitta nya läkemedel, men också behöver utveckla nya sätt att hitta dem. Bland de mest lovande kandidaten metoder är hel-organismen, in-vivo -analyser att använda hög genomströmning, fenotypiska utläsningar och värd som spänner från Caenorhabditis elegans till Danio rerio. Dessa värdar har flera starka fördelar, inklusive dramatiska minskningar falska positiva träffar, som föreningar som är giftiga för de mottagande och/eller biounavailable släpps normalt i den första skärmen, före kostsamma följa upp.
Här visar vi hur vår analys har använts för att förhöra värd variation i den väldokumenterade C. elegans—Pseudomonas aeruginosa flytande döda pathosystem. Vi visar också flera förlängningar av denna väl fungerade ut teknik. Exempelvis kan vi utföra hög genomströmning genetiska skärmar med hjälp av RNAi i 24 – eller 96-bra platta format till fråga värd faktorer i denna värd-patogen interaktion. Med denna analys, kan hela genomet skärmar fyllas i bara några månader, som dramatiskt förenklar uppgiften att identifiera läkemedelsmål, potentiellt utan behov av mödosamma biokemisk rening metoder.
Vi rapporterar också här en variant av vår metod som ersätter grampositiva bakterien Enterococcus faecalis för gramnegativ patogen P. aeruginosa. Mycket som är fallet för P. aeruginosa, är dödandet av E. faecalis tidsberoende. Till skillnad från tidigare C. elegans—E. faecalis analyser, vår analys för E. faecalis inte kräver preinfection, förbättra dess säkerhetsprofil och minska risken för kontamination med vätska-hanteringsutrustning. Analysen är mycket robust, visar ~ 95% dödstalen 96 h post infektion.
Introduction
Identifiering och utveckling av effektiva, brett spektrum antibiotika, nu nästan ett sekel sedan, ledde till en vattendelare ögonblick i folkhälsa där det fanns en utbredd tro att smittsam sjukdom skulle vara ett gissel av förflutnan. Inom några korta decennier började denna optimism avta, som patogen efter patogen framkallade resistensmekanismer som begränsade dessa en gång mirakulösa behandlingar. För en tid verkade kapprustningen mellan drug discovery ansträngningar och patogenerna balanserad. Missbruk av antimikrobiella medel har dock nyligen kulminerade i uppkomsten av pan-resistenta stammar av Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensoch P. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa är en opportunistisk, gram negativ, multi-värd patogen som är ett allvarligt hot mot patienter med svåra brännskador, dem som är immunsupprimerade, eller har cystisk fibros. Det är också alltmer identifierad som en orsakande agens i allvarliga nosokomiala infektioner, särskilt på grund av dess pågående förvärv av antimikrobiell resistens. Till att börja med att ta itu med detta hot har vi använt den väldokumenterade C. elegans–P. aeruginosa infektion system5. Vårt labb har leveraged detta system för att utveckla en vätskebaserade, hög kapacitet, hög-innehåll screening plattform för att identifiera nya föreningar som begränsar sjukdomsalstrande förmåga att döda den värd6. Dessa föreningar verkar spännande, tillhör minst tre allmänna kategorier, inklusive antimikrobiella medel7 och virulens hämmare8. Andra high-innehåll drug discovery analyser i C. elegans har rapporterats för Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, och Enterococcus faecalis, bland annat9,10,11,12,13,14,15,16. Dessa typer av analyser har flera välkända fördelar, till exempel begränsa falska positiva träffar som kan vara giftigt för både värd och patogen, ökad sannolikhet för biotillgänglighet jämfört med en kemisk skärm och förmågan att identifiera träffar utanför helt enkelt begränsa mikrobiell tillväxt, såsom anti-virulents, immun stimulerande molekyler eller föreningar som annars lutar balansen i värd-patogen interaktionen till förmån för den tidigare. De föreningar som upptäcktes i dessa skärmar är dessutom ofta effektiva i däggdjur värdar.
Det är värt att notera att det finns minst två andra analyser17,18 att utföra hög genomströmning skärmar i C. elegans i vätska. Dock var och en av dessa analyser är en ändring som tillåter prototypiska intestinal-colonization analysen, känd som långsam-dödande, ska utföras i flytande öka genomströmningen och låta föreningar elektronikkedjan lättare. Noggrann karakterisering har slutgiltigt visat att bakteriell virulens mekanismer är olika mellan dessa analyser och vår vätskebaserade skärmen7. Eftersom båda typerna av virulens observeras i däggdjur system, är det viktigt att överväga vilka virulens avgörande är mest relevanta för de experimenter’s intressen före assay urval.
Här visar vi en optimerad version av de vätskebaserade C. elegans-P. aeruginosa assay. Vi rapporterar också anpassningen av vår vätskebaserade analys metod att rymma grampositiva bakterie patogenen Enterococcus faecalis. Som P. aeruginosaidentifieras E. faecalis alltmer som ett allvarliga nosokomiala hot med en växande rustningen av antimikrobiell resistens vägar1. Även om det finns14en föregående metod för high-throughput screening av E. faecalis , kräver det preinfection med patogener, vilket försvårar förfarandet och ökar risken för kontamination med utrustning som de COPAS FlowSort. Våra protokoll eliminerar behovet av före infektion, förbättra säkerhetsprofilen. Slutligen, Vi rapporterar ett medel genom vilket antingen av dessa analyser kan kombineras med utfodring RNAi, tillåt förbrukaren till söka för värd faktorer som spelar en roll i etableringen av, eller motstånd mot, infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna assay (eller liknande analyser där andra patogener ersätts för P. aeruginosa eller E. faecalis) är användbar för en mängd ändamål, inklusive läkemedelsutveckling. Det är också användbart för att hantera grundläggande biologiska frågor, såsom att fastställa virulensfaktorer, förtydligandet av värd försvar vägar, och att fastställa rättsliga maskineriet inblandad i värd-patogen interaktionen.
Även om P. aeruginosa flytande dödande analy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av cancerprevention och Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch stiftelsen forskning Grant C-1930, och av de nationella institut för hälsa K22 AI110552 tilldelas NVK. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
References
- Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
- Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
- Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
- Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
- Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
- Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
- Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
- Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
- Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
- Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
- Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).
- Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
- Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
- Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
- Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).
- Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).
- Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).
- Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
- Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
- Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
- Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).
- Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
- Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
- Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).
