Abrasion épithéliale cornéenne avec oculaire Burr comme modèle pour la cornée, la cicatrisation

Summary

Ce protocole décrit une méthode pour infliger une abrasion de la surface oculaire de la souris et de suivre la processus de cicatrisation par la suite. Le protocole profite d’une bavure oculaire pour éliminer partiellement l’épithélium de surface de le œil chez les souris anesthésiés.

Abstract

La cornée murine fournit un excellent modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. La cornée est la couche la plus externe de le œil et est donc la première défense des blessures. En fait, le type le plus commun de blessure à l’oeil dans la clinique est une abrasion cornéenne. Ici, nous utilisons une bavure oculaire pour provoquer une usure résultant en retrait de l’épithélium cornéen in vivo sur des souris anesthésiés. Cette méthode permet de perturbation épithéliale ciblée et reproductible, laissant les autres zones intactes. En outre, nous décrire la visualisation de l’épithélium abrasée avec coloration de fluorescéine et fournir des conseils concrets sur la façon de visualiser la cornée abrasée. Puis, nous suivons la chronologie de la cicatrisation 0, 18 et 72 h après abrasion, jusqu’à ce que la plaie est re-epithelialized. Le modèle d’abrasion épithéliales de lésion de la cornée est idéal pour les études sur la prolifération des cellules épithéliales, de migration et de ré-épithélialisation des couches cornéens. Toutefois, cette méthode n’est pas optimale pour étudier l’activation stromale lors de la cicatrisation des plaies, car la bavure oculaire ne pénètre pas dans les couches de cellules stromales. Cette méthode convient également pour des applications cliniques, par exemple, de l’essai préclinique de l’efficacité des médicaments.

Introduction

Les couches épithéliales de nombreux organes sont exposés à des blessures. Toutefois, ils contiennent également de la possibilité de compenser pour la perte de tissu grâce à la cicatrisation des plaies. La cornée offre un excellent modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. Il forme la surface externe de le œil et fournit une couche de protection pour les machines sensibles oculaire. Ainsi, la cornée fonctionne comme une barrière physique aux pathogènes et aux pertes d’eau. Elle est composée de trois couches ; épithélium et stroma, endothélium. L’épithélium de la cornée constitue la couche la plus superficielle de la cornée. Cellules épithéliales maintiennent la fonction barrière de la cornée en respectant strictement les uns aux autres par l’intermédiaire de jonctions serrées^1,2,3. Une membrane de sous-sol cornée acellulaire, membrane de Bowman, sépare l’épithélium du stroma étendue, qui contient des keratocytes réfractaire. Dans le stroma, endothélium canal de nutriments, l’eau et l’oxygène de la couche supérieure.

Abrasion de la cornée est très fréquents dans la clinique⁴. Lésions de la cornée sont diverses, mais sont en grande partie causées par de petites particules telles que la poussière ou de sable, des égratignures ou autres corps étrangers. Le protocole décrit ici vise à reproduire un type cliniquement pertinent d’abrasion épithéliale cornéenne. Ce faisant, ce protocole fournit une méthode contrôlable et séminale de cliniciens et de chercheurs cornéennes mettre en œuvre leurs propres études. Nous avons effectué un test de réparation in vivo des blessures sur la cornée murine par abrasion les tissus avec une ronce oculaire Terni, l’II Algerbrush. Ici, nous ciblons l’abrasion uniquement à l’épithélium cornéen central et laisser les autres parties de l’organe sans dommages. Ainsi, le protocole est idéal pour l’étude des cellules épithéliales cornéennes dynamique ou de la membrane basale au cours de la ré-épithélialisation, cell migration, la prolifération et la différenciation en vivo⁵. Récemment, ce modèle a été utilisé pour analyser la dynamique de cellules progénitrices dans la cornée murine, aussi bien quant à dévoiler la capacité des cellules épithéliales cornéennes différenciées en rétablissant le créneau de la cornée des cellules souches après blessure^6,7. Suite à l’abrasion, la cornée revient à sa transparence normale et la résistance à la traction. Fait intéressant, une étude in vitro a indiqué que réépithélialisation s’effectue sans de prolifération accrue des cellules⁸. Ce protocole décrit la chronologie de la guérison sans interruption dans la cornée murine. La méthode est donc applicable pour tester l’effet des drogues sur la guérison des patrons et vitesse.

La cornée a été largement utilisée pour les études de cicatrisation. Cependant, de nombreuses études ont compté sur d’autres modèles de blessure. Un modèle bien établi de lésion de la cornée est la brûlure alcaline qui est effectuée par l’application d’hydroxyde de sodium (NaOH) avec ou sans filtre papier sur la surface cornéenne⁹. Exposition alcaline provoque une blessure large et diffuse qui affecte non seulement l’épithélium cornéen, mais aussi la conjonctive et stroma^9,10. Les solutions alcalines fortes montrent pour provoquer des ulcères cornéens, opacification et une néovascularisation⁹. Cellules inflammatoires envahissent le stroma généralement dans les 6 h et y restent jusqu’à 24 heures¹¹. Ainsi, blessure alcaline est une méthode utile dans les études liées à l’activation stromale. Un autre type de lésion chimique peut être infligé en appliquant le diméthylsulfoxyde (DMSO) sur la cornée^9,10. Autres modèles de lésion couramment utilisés comprennent des plaies cicatricielles qui pénètrent par les blessures de stroma et réfractive, qui sont limités à la partie supérieure du stroma^14,15. Ces méthodes sont également utiles pour répondre aux questions au sujet de la guérison des plaies stromales. Modèles de lésion différents ont leurs propres avantages et inconvénients. Abrasion ou débridement, de l’épithélium de la cornée a été développée à l’aide de scalpels ternis ou lames sur ex vivo cornées¹⁶. Cette méthode a plus tard été utilisés in vivo sur des souris, rat et lapin^{17,18,19,20,21,22}. À l’aide de la bavure oculaire (Figure 1), nous enlever seulement une zone sélectionnée de l’épithélium, laissant le reste de l’épithélium pas affectée. De cette façon, il est possible de cibler précisément l’élimination épithéliale dans différentes parties de la cornée. En outre, la taille de l’abrasion pouvant être évaluée par la coloration de fluorescéine. En outre, ici, nous suivons fermeture abrasion au cours de la période de cicatrisation.

Cette méthode présente plusieurs avantages, i) y compris la localisation précise du site de l’abrasion, qui n’est pas possible avec lésion chimique, ii) l’abrasion est rapide à réaliser, et iii) il est non invasif. Dans les présentes, nous décrivent la méthode à l’aide de la souris NMRI non-consanguines comme modèle, mais cela pourrait s’appliquer à la vaste gamme de modèles génétiques de la souris, ainsi que pour le rat et le lapin, qui est des modèles communs utilisés pour étudier les perturbations cornée humaine.

Protocol

Toutes les expériences sont approuvées par le Conseil national d’expérimentation animale. 1. les préparatifs Préparer toutes les solutions et les garder à température ambiante, sauf indication contraire. Suivre les règlements d’élimination des déchets aux solutions et matériaux dispose utilisé. Utilisation NMRI et ICR tel stocks, entre les âges 4-12 semaines et ou l’autre sexe. Si vous utilisez la souche C57BL/6, suivre la méthode de préparation de két…

Representative Results

Ce protocole décrit un modèle visant à infliger une blessure à l’abrasion de la cornée de souris et suggère comment suivre et de visualiser le processus de guérison après l’abrasion. Récemment, nous avons utilisé cette méthode pour étudier le rôle des cellules souches épithéliales cornéennes pendant la cicatrisation6. L’utilisation des outils établis est la clé d’une expérience réussie à l’abrasion. Nous et autres, avons utilisé les …

Discussion

Méthodes blessantes sont populaires outils d’étudier différents aspects de l’homéostasie cornéenne et pathologies. Le modèle de l’abrasion offre une méthode bien maîtrisée pour résoudre des problèmes pertinents en ophtalmologie. Cependant, certains points critiques dans le protocole sont intéressant de souligner. Notamment, des détails présentés au sujet de la médecine vétérinaire, chronologie guérison de blessure et résultat sont optimisés pour une utilisation avec des stocks non consanguins d…

Materials

NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA