Hornhinnans epitel nötning med okulär Burr som modell för hornhinnan sårläkning
Summary
Det här protokollet beskriver en metod att tillfoga ett skrapsår på den okulära ytan av musen och följa sårläkningsprocessen därefter. Protokollet tar fördel av en okulär burr delvis bort ytan epitelet i ögat i bedövat möss.
Abstract
Murina hornhinnan ger en utmärkt modell för att studera sårläkning. Hornhinnan är det yttersta lagret av ögat, och således är det första försvaret att skada. I själva verket är den vanligaste typen av ögonskador Funna i kliniken en korneal nötning. Här använder vi en okulär burr för att inducera ett skrapsår som resulterar i borttagning av hornhinnans epitel i vivo på sövda möss. Denna metod möjliggör riktade och reproducerbara epitelial störningar, medan andra områden intakt. Dessutom vi beskriva visualisering av skadad epitel med fluorescein färgning och ge konkreta råd om hur att visualisera skadad kornea. Sedan följer vi tidslinjen för sårläkning 0, 18 och 72 h efter nötning, tills såret är åter epithelialized. Epitelial nötning modellen korneal skada är idealisk för studier på epitelial cell spridning, migration och återepitelisation hornhinnans lager. Denna metod är dock inte optimal att studera stromal aktivering under sårläkning, eftersom den okulära burr inte tränger till de stromal cell-lagrarna. Denna metod är också lämplig för kliniska tillämpningar, till exempel prekliniska test av drogen effektivitet.
Introduction
Epitelial skikt av talrika organ utsätts för skador. Men innehåller de också förmågan att kompensera vävnad genom sårläkning. Hornhinnan erbjuder en utmärkt modell för att studera sårläkning. Det bildar den yttre ytan av ögat och ger ett skyddande lager för den känsliga okulär maskinen. Hornhinnan fungerar således som en fysisk barriär till patogener och vattenförlust. Den består av tre lager; epitel, stroma och endotel. Epitelet i hornhinnan gör upp det yttersta lagret av hornhinnan. Epitelceller upprätthålla barriärfunktionen av hornhinnan genom att följa strikt varandra genom åtsittande föreningspunkter1,2,3. Ett acellulärt korneal basalmembranet, den Bowmans membran, avgränsar epitelet från omfattande stroma, som innehåller eldfasta keratocyter. Endotelceller kanal under stroma, näringsämnen, vatten och syre till det övre lagret.
Hornhinnan skrubbsår är mycket vanliga i kliniken4. Skador på hornhinnan är olika, men till stor del orsakade av små partiklar såsom damm eller sand, repor eller andra främmande föremål. Protokollet beskrivs här syftar till att reproducera en kliniskt relevant typ av hornhinnans epitel nötning. Så ger det här protokollet en kontrollerbar och banbrytande metod för kliniker och korneal forskare för att genomföra egna studier. Vi har utfört en reparation i vivo skada analys på murina hornhinnan av slipning vävnaden med en avtrubbade okulär burr, den Algerbrush II. Här, vi riktar nötning endast till det centrala hornhinnans epitelet och lämna de andra delarna av orgeln utan skador. Således, protokollet är idealisk för studien korneal epitelial cell dynamics eller basalmembranet under återepitelisation, cell migration, proliferation och differentiering i vivo5. Nyligen har användes denna modell för att analysera progenitor cell dynamics i murina hornhinnan samt att avslöja kapaciteten av differentierade korneal epitelceller återupprätta korneal stamcellsnischen efter skada6,7. Efter nötning, hornhinnan återgår till sin normala öppenhet och draghållfasthet. Intressant, anges en in vitro- studie att återepitelisation sker utan ökad cell spridning8. Det här protokollet beskriver tidslinjen av oavbruten healing i murina hornhinnan. Metoden gäller således att testa effekten av läkemedel på healing mönster och hastighet.
Hornhinnan har använts i stor utsträckning för sårläkning studier. Men många studier har förlitat sig på andra modeller av skada. En väletablerad modell av korneal skada är alkaliska brännskadan som utförs genom att tillämpa natriumhydroxid (NaOH) med eller utan filterpapper på hornhinnans yta9. Alkaliska exponering resulterar i en stor och diffus skada som påverkar inte bara hornhinneepitelet, men också de bindhinna och stroma9,10. Starka alkaliska lösningar har visats inducera kärlnybildning9korneal sår och kontrastverkan. Inflammatoriska celler invaderar stroma vanligtvis inom 6 h och stanna kvar där tills 24 h11. Alkaliska skada är alltså en lämpligt metod i studier relaterade till stromal aktivering. En annan typ av kemisk skada kan åsamkas genom tillämpning av dimetyl sulfoxid (DMSO) på hornhinnan9,10. Andra vanliga skador modeller inkluderar incisional sår som tränger igenom stroma och keratectomy såren, som är begränsade till den övre delen av stroma14,15. Dessa metoder är också användbart för att besvara frågor angående stromal sårläkning. Annan skada modeller har sina egna fördelar och nackdelar. Nötning eller debridering, av hornhinnans epitel utvecklades först med slöa skalpeller eller blad på ex vivo hornhinnor16. Denna metod har senare varit används i vivo på mus, råtta och kanin17,18,19,20,21,22. Använder den okulära burr (figur 1), vi tar bort endast en vald region av epitel, lämnar resten av epitelet opåverkad. Detta sätt, är det möjligt att exakt rikta epitelial borttagningen till olika delar av hornhinnan. Dessutom kan nötning storlek bedömas med fluorescein färgning. Dessutom följa här vi nötning stängning under läkningsperioden.
Denna metod medför flera fördelar, i) inklusive exakt lokalisering av nötning webbplats, som inte är möjligt med kemisk skada, ii) nötning går snabbt att utföra, och iii) det är icke-invasiv. Häri, beskriver vi metoden med outbred NMRI musen som modell, men detta kan tillämpas till det stora utbud av mus genetiska modeller, samt till råtta och kanin, som är gemensamma modeller som används för att studera mänskliga korneala störningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skadade metoder är populära verktyg att studera olika aspekter av hornhinnans homeostas och patologier. Nötning modellen erbjuder en väl kontrollerad metod för att ta itu med relevanta problem i oftalmologi. Vissa kritiska punkter i protokollet är dock värt att poängtera. Särskilt, Detaljer beskrivs avseende veterinärmedicin, sår läkning tidslinje och resultatet är optimerade för användning med utkonkurrerat dö ut NMRI och ICR bestånd, men kan variera bland stammar av möss26. Med…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Kaisa Ikkala för hennes ovärderliga tekniskt bistånd och insiktsfulla hjälp när aktualerande denna metod liksom senare under genomförandet till vår centrala forskningsfrågor. Vi vill också tacka Laboratory Animal Center och Anna Meller för hennes hjälp med att planera riktlinjerna i veterinära arbetet.
Materials
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Biologie du développement. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -. K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- . Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018)
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
