Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

Jarmila Kralova; Daniela Glatzova; Simon Borna; Tomas Brdicka

doi:10.3791/58081

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Article de méthode

Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

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DOI :

10.3791/58081

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30 octobre 2018

Jarmila Kralova¹^,² , Daniela Glatzova¹^,²^,³ , Simon Borna¹^,² , Tomas Brdicka¹

¹Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, ²Faculty of Science, Charles University, ³Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous fournissons qu'un protocole détaillé pour l’expression des protéines de fusion fluorescent murin de moelle osseuse provenant des macrophages et les cellules dendritiques. La méthode est basée sur la transduction de la moelle osseuse progéniteurs avec constructions retroviral suivies de différenciation en macrophages et dendritiques des cellules in vitro.

Résumé

Les macrophages et les cellules dendritiques sont des cellules cruciales qui forment la première ligne de défense contre les agents pathogènes. Ils jouent également un rôle important dans le déclenchement d’une réponse immunitaire adaptative. Des travaux expérimentaux avec ces cellules sont plutôt difficile. Leur abondance dans les organes et les tissus est relativement faible. Ainsi, ils ne peuvent pas être isolés en grand nombre. Ils sont également difficiles à transfecter constructions d’ADNc. Dans le modèle murin, ces problèmes peuvent être partiellement résolus par in vitro la différenciation des progéniteurs de la moelle osseuse en présence de M-CSF pour les macrophages ou GM-CSF pour les cellules dendritiques. De cette façon, il est possible d’obtenir de grandes quantités de ces cellules de très peu d’animaux. En outre, les cellules souches de la moelle osseuse peuvent être transduites avec des vecteurs rétroviraux transportant des constructions de l’ARNC durant les premiers stades de la culture avant leur différenciation dans la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages. Ainsi, transduction rétrovirale, suivie par la différenciation in vitro peut être utilisée pour exprimer les diverses constructions de cDNA dans ces cellules. La capacité d’exprimer les protéines ectopiques considérablement élargit sa gamme d’expériences qui peuvent être effectuées sur ces cellules, y compris l’imagerie de cellules vivantes de protéines fluorescentes, des purifications en tandem pour les analyses de l’interactome, analyses de la structure-fonction, le contrôle des fonctions cellulaires avec biocapteurs et bien d’autres. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour la transduction rétrovirale du murin de la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages avec vecteurs codant pour des protéines fluorescent-étiquetées. L’exemple de deux protéines d’adaptateur, OPAL1 et PSTPIP2, nous démontrons son application pratique en cytométrie en flux et en microscopie. Nous discuterons les avantages et les limites de cette approche.

Introduction

Cellules myéloïdes représentent un élément indispensable de nos mécanismes de défense contre les agents pathogènes. Ils sont capables d’éliminer rapidement les microbes, mais aussi les cellules mourantes. En outre, ils sont également impliqués dans la régulation de réparation et développement des tissus et dans le maintien de l’homéostasie du¹^,²^,³. Toutes les cellules myéloïdes différencient des progéniteurs myéloïdes communs dans la moelle osseuse. Leur différenciation en plusieurs sous-ensembles distincts morphologiquement et fonctionnellement est largement contrôlée par le....