تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة
Summary
في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في نخاع العظام مورين اشتقاق الخلايا الجذعية والضامة. ويستند الأسلوب في توصيل نخاع العظام المتكفل بنيات فيروسات النسخ العكسي متبوعاً بتمايز إلى الضامة والجذعيه الخلايا في المختبر.
Abstract
الخلايا الجذعية والضامة هي خلايا الحاسمة التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة. كما أنها تؤدي أدواراً هامة في بدء استجابة مناعية تكيفية. العمل التجريبي مع هذه الخلايا بدلاً من ذلك التحدي. كثرة في الأعضاء والأنسجة منخفضة نسبيا. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن تكون معزولة بإعداد كبيرة. وأيضا صعوبة في ترانسفيكت مع بنيات كدنا. في طراز مورين، يمكن تجاوز هذه المشاكل جزئيا بالتمايز في المختبر من فروعه نخاع العظام بحضور م-CSF الضامة أو GM-CSF للخلايا الجذعية. وبهذه الطريقة، من الممكن الحصول على كميات كبيرة من هذه الخلايا من عدد قليل جداً من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ترانسدوسيد المتكفل نخاع العظام مع الفيروسات التراجعية ناقلات تحمل نيات كدنا خلال المراحل المبكرة لزراعة قبل على التمايز في الخلايا الجذعية نخاع العظام المشتقة والضامة. وهكذا، يمكن توصيل النسخ العكسي متبوعاً بتمايز في المختبر للتعبير عن مختلف بنيات كدنا في هذه الخلايا. القدرة على التعبير عن البروتينات خارج الرحم إلى حد كبير يمتد مجموعة التجارب التي يمكن إجراؤها على هذه الخلايا، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية من البروتينات الفلورية، وتنقية جنبا إلى جنب لتحليلات إينتيراكتومي، تحليل بنية دالة، ورصد الوظائف الخلوية مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وغيرها الكثير. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصل لتوصيل النسخ العكسي للخلايا الجذعية نخاع العظام موريني المشتقة والضامة مع ناقلات الترميز لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات. على سبيل المثال من اثنين من البروتينات محول، OPAL1 و PSTPIP2، علينا أن نظهر تطبيقه العملي في التدفق الخلوي والفحص المجهري. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود من هذا النهج.
Introduction
وتمثل الخلايا النقوي جزءا لا يتجزأ من آليات الدفاع لدينا ضد مسببات الأمراض. فقادرة على سرعة القضاء على الميكروبات، فضلا عن خلايا الموت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها تشارك في تنظيم التنمية الأنسجة وإصلاح والحفاظ على التوازن1،،من23. كافة الخلايا النقوي تفرق من فروعه النقوي الشائعة في نخاع العظام. على التمايز إلى عدة مجموعات فرعية متميزة وظيفيا وشكليا إلى حد كبير تسيطر عليها السيتوكينات وعلى تركيبات مختلفة4. وتشمل المجموعات الأكثر كثافة درس الخلية النقوي المحببة بالعدلات والضامة والخلايا الجذعية. عيوب في أي من هؤلاء السكان يؤدي إلى عواقب تهدد الحياة وسبب الخلل الشديد في الجهاز المناعي لدى البشر والفئران1،2،،من35، 6.
خلافا بالعدلات المحببة، الخلايا الجذعية والضامة خلايا الأنسجة المقيمين وعلى وفرة في أجهزة المناعة منخفضة نسبيا. نتيجة لذلك إلى العزلة وتنقية الخلايا الجذعية الأولية والضامة للتجارب التي تتطلب عددا كبيرا من هذه الخلايا مكلفة وغالباً ما يكون من المستحيل. لحل هذه المشكلة، وضعت بروتوكولات للحصول على كميات كبيرة من الضامة متجانسة أو الخلايا الجذعية في المختبر. تستند هذه النهج على التفريق بين خلايا نخاع العظام موريني حضور السيتوكينات: بلعم محفزة لمستعمرة عامل (م-CSF) الضامة وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (GM-CSF) أو يجند Flt3 ل الخلايا الجذعية7،،من89،10،،من1112. ويرد عادة الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب في الأدب نخاع العظام المستمدة الضامة (بمدمس)، ونخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية (بمدكس). لديهم المزيد من الخصائص الفسيولوجية مشتركة مع الابتدائي الضامة أو الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا المناظرة. ميزة رئيسية أخرى إمكانية الحصول على هذه شكل خلايا وراثيا تعديل الفئران13. الدراسات المقارنة بين البرية من نوع الخلايا والخلايا المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا غالباً ما تكون حاسمة بالنسبة لوظائف الرواية الكشف عن الجينات أو البروتينات للفائدة.
تحليل التعريب سوبسيلولار للبروتينات في الخلايا الحية يتطلب اقتران تسمية الفلورسنت للبروتين من الفائدة في فيفو. الأكثر شيوعاً ويتحقق ذلك بالإعراب عن بناء الانصهار وراثيا المرمزة تتألف من البروتين تم تحليلها الاقتران (غالباً عن طريق رابط قصيرة) إلى بروتين فلوري (مثلاً.، أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء))14،15 , 16-التعبير عن كلمات فلوريسسينتلي البروتينات في الخلايا الجذعية أو الضامة التحدي. هذه الخلايا عموما من الصعب ترانسفيكت بالإجراءات القياسية تعداء وأوجه الكفاءة التي تميل إلى أن تكون منخفضة جداً. وعلاوة على ذلك، تعداء عابر وأنه يولد الإجهاد الخلوية وكثافة المحققة من الأسفار قد لا تكون كافية للفحص المجهري17. من أجل الحصول على جزء معقول من هذه الخلايا مع مستوى كاف من التعبير التحوير، وعدوى الخلايا السلف نخاع العظام مع النسخ العكسي أصبحت هذه التفرقة اللاحقة إلى بمدمس أو بمدكس ومتجهات فعالة جداً النهج. وقد أتاح تحليل البروتينات النقوي المنشأ في بيئتها الخلوية الأصلية، سواء في حالة مستقرة أو أثناء العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية مثل البلعمه، وتشكيل المشبك المناعية أو الهجرة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يسمح لتعبير مستقر من البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة الاهتمام بنخاع العظام موريني المستمدة الضامة، والخلايا الجذعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعبير عن بروتين فائدة في الخلايا الهدف خطوة رئيسية في العديد من أنواع الدراسات البيولوجية. الضامة متمايزة والخلايا الجذعية من الصعب أن ترانسفيكت من تعداء القياسية وتقنيات توصيل النسخ العكسي. تجاوز تعداء هذه الخلايا المتمايزة بتوصيل النسخ العكسي من فروعه نخاع العظام، تليها التمايز عند…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بالتشيكية العلم مؤسسة (جاكر) (المشروع رقم 16-07425S)، تشارلز الجامعة منحة الوكالة (جاك) (رقم المشروع 923116) وعن طريق التمويل المؤسسي من معهد الوراثة الجزيئية، أكاديمية العلوم التشيكية الجمهورية (رفو 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
