في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في نخاع العظام مورين اشتقاق الخلايا الجذعية والضامة. ويستند الأسلوب في توصيل نخاع العظام المتكفل بنيات فيروسات النسخ العكسي متبوعاً بتمايز إلى الضامة والجذعيه الخلايا في المختبر.
الخلايا الجذعية والضامة هي خلايا الحاسمة التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة. كما أنها تؤدي أدواراً هامة في بدء استجابة مناعية تكيفية. العمل التجريبي مع هذه الخلايا بدلاً من ذلك التحدي. كثرة في الأعضاء والأنسجة منخفضة نسبيا. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن تكون معزولة بإعداد كبيرة. وأيضا صعوبة في ترانسفيكت مع بنيات كدنا. في طراز مورين، يمكن تجاوز هذه المشاكل جزئيا بالتمايز في المختبر من فروعه نخاع العظام بحضور م-CSF الضامة أو GM-CSF للخلايا الجذعية. وبهذه الطريقة، من الممكن الحصول على كميات كبيرة من هذه الخلايا من عدد قليل جداً من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ترانسدوسيد المتكفل نخاع العظام مع الفيروسات التراجعية ناقلات تحمل نيات كدنا خلال المراحل المبكرة لزراعة قبل على التمايز في الخلايا الجذعية نخاع العظام المشتقة والضامة. وهكذا، يمكن توصيل النسخ العكسي متبوعاً بتمايز في المختبر للتعبير عن مختلف بنيات كدنا في هذه الخلايا. القدرة على التعبير عن البروتينات خارج الرحم إلى حد كبير يمتد مجموعة التجارب التي يمكن إجراؤها على هذه الخلايا، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية من البروتينات الفلورية، وتنقية جنبا إلى جنب لتحليلات إينتيراكتومي، تحليل بنية دالة، ورصد الوظائف الخلوية مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وغيرها الكثير. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصل لتوصيل النسخ العكسي للخلايا الجذعية نخاع العظام موريني المشتقة والضامة مع ناقلات الترميز لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات. على سبيل المثال من اثنين من البروتينات محول، OPAL1 و PSTPIP2، علينا أن نظهر تطبيقه العملي في التدفق الخلوي والفحص المجهري. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود من هذا النهج.
وتمثل الخلايا النقوي جزءا لا يتجزأ من آليات الدفاع لدينا ضد مسببات الأمراض. فقادرة على سرعة القضاء على الميكروبات، فضلا عن خلايا الموت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها تشارك في تنظيم التنمية الأنسجة وإصلاح والحفاظ على التوازن1،،من23. كافة الخلايا النقوي تفرق من فروعه النقوي الشائعة في نخاع العظام. على التمايز إلى عدة مجموعات فرعية متميزة وظيفيا وشكليا إلى حد كبير تسيطر عليها السيتوكينات وعلى تركيبات مختلفة4. وتشمل المجموعات الأكثر كثافة درس الخلية النقوي المحببة بالعدلات والضامة والخلايا الجذعية. عيوب في أي من هؤلاء السكان يؤدي إلى عواقب تهدد الحياة وسبب الخلل الشديد في الجهاز المناعي لدى البشر والفئران1،2،،من35، 6.
خلافا بالعدلات المحببة، الخلايا الجذعية والضامة خلايا الأنسجة المقيمين وعلى وفرة في أجهزة المناعة منخفضة نسبيا. نتيجة لذلك إلى العزلة وتنقية الخلايا الجذعية الأولية والضامة للتجارب التي تتطلب عددا كبيرا من هذه الخلايا مكلفة وغالباً ما يكون من المستحيل. لحل هذه المشكلة، وضعت بروتوكولات للحصول على كميات كبيرة من الضامة متجانسة أو الخلايا الجذعية في المختبر. تستند هذه النهج على التفريق بين خلايا نخاع العظام موريني حضور السيتوكينات: بلعم محفزة لمستعمرة عامل (م-CSF) الضامة وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (GM-CSF) أو يجند Flt3 ل الخلايا الجذعية7،،من89،10،،من1112. ويرد عادة الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب في الأدب نخاع العظام المستمدة الضامة (بمدمس)، ونخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية (بمدكس). لديهم المزيد من الخصائص الفسيولوجية مشتركة مع الابتدائي الضامة أو الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا المناظرة. ميزة رئيسية أخرى إمكانية الحصول على هذه شكل خلايا وراثيا تعديل الفئران13. الدراسات المقارنة بين البرية من نوع الخلايا والخلايا المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا غالباً ما تكون حاسمة بالنسبة لوظائف الرواية الكشف عن الجينات أو البروتينات للفائدة.
تحليل التعريب سوبسيلولار للبروتينات في الخلايا الحية يتطلب اقتران تسمية الفلورسنت للبروتين من الفائدة في فيفو. الأكثر شيوعاً ويتحقق ذلك بالإعراب عن بناء الانصهار وراثيا المرمزة تتألف من البروتين تم تحليلها الاقتران (غالباً عن طريق رابط قصيرة) إلى بروتين فلوري (مثلاً.، أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء))14،15 , 16-التعبير عن كلمات فلوريسسينتلي البروتينات في الخلايا الجذعية أو الضامة التحدي. هذه الخلايا عموما من الصعب ترانسفيكت بالإجراءات القياسية تعداء وأوجه الكفاءة التي تميل إلى أن تكون منخفضة جداً. وعلاوة على ذلك، تعداء عابر وأنه يولد الإجهاد الخلوية وكثافة المحققة من الأسفار قد لا تكون كافية للفحص المجهري17. من أجل الحصول على جزء معقول من هذه الخلايا مع مستوى كاف من التعبير التحوير، وعدوى الخلايا السلف نخاع العظام مع النسخ العكسي أصبحت هذه التفرقة اللاحقة إلى بمدمس أو بمدكس ومتجهات فعالة جداً النهج. وقد أتاح تحليل البروتينات النقوي المنشأ في بيئتها الخلوية الأصلية، سواء في حالة مستقرة أو أثناء العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية مثل البلعمه، وتشكيل المشبك المناعية أو الهجرة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يسمح لتعبير مستقر من البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة الاهتمام بنخاع العظام موريني المستمدة الضامة، والخلايا الجذعية.
التعبير عن بروتين فائدة في الخلايا الهدف خطوة رئيسية في العديد من أنواع الدراسات البيولوجية. الضامة متمايزة والخلايا الجذعية من الصعب أن ترانسفيكت من تعداء القياسية وتقنيات توصيل النسخ العكسي. تجاوز تعداء هذه الخلايا المتمايزة بتوصيل النسخ العكسي من فروعه نخاع العظام، تليها التمايز عند…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل بالتشيكية العلم مؤسسة (جاكر) (المشروع رقم 16-07425S)، تشارلز الجامعة منحة الوكالة (جاك) (رقم المشروع 923116) وعن طريق التمويل المؤسسي من معهد الوراثة الجزيئية، أكاديمية العلوم التشيكية الجمهورية (رفو 68378050).
DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |