Udtryk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine knoglemarv-afledte dendritiske celler og makrofager
Summary
I denne artikel vil give vi en detaljeret protokol for udtryk for fluorescerende fusion proteiner i murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager. Metoden er baseret på transduktion af knoglemarv stamceller med retroviral konstruktioner efterfulgt af differentiering af makrofager og dendritiske celler i vitro.
Abstract
Dendritiske celler og makrofager er afgørende celler, der danner den første linje i forsvar mod patogener. De også spille en vigtig rolle i iværksættelsen af en adaptiv immunrespons. Eksperimentelt arbejde med disse celler er temmelig udfordrende. Deres overflod i organer og væv er relativt lavt. Som et resultat, kan ikke de være isoleret i stort tal. De er også svært at transfect med cDNA konstruktioner. I murine modellen, kan disse problemer løses delvist af in vitro- differentiering fra knoglemarven stamfaderen M-CSF for makrofager eller GM-CSF for dendritiske celler. På denne måde er det muligt at opnå store mængder af disse celler fra meget få dyr. Derudover kan knoglemarv stamceller være transduced med retroviral vektorer transporterer cDNA konstruktioner i tidlige stadier af dyrkning før deres differentiering i knoglemarven afledt dendritiske celler og makrofager. Retroviral transduktion efterfulgt af differentiering i vitro kan således bruges til at udtrykke forskellige cDNA konstruktioner i disse celler. Evnen til at udtrykke ektopisk proteiner betydeligt udvider rækken af eksperimenter, der kan udføres på disse celler, herunder levende celle billeddannelse af fluorescerende proteiner, tandem purifications interactome analyser, struktur-funktion analyser, overvågning af cellulære funktioner med biosensorer og mange andre. I denne artikel vil beskrive vi en detaljeret protokol til retroviral transduktion af murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager med vektorer, der koder for fluorescently markeret proteiner. På eksemplet med to adapter proteiner, OPAL1 og PSTPIP2, vise vi sin praktiske anvendelse i flowcytometri og mikroskopi. Vi diskuterer også fordele og begrænsninger ved denne fremgangsmåde.
Introduction
Myeloide celler udgør en uundværlig del af vores forsvarsmekanismer mod patogener. De er i stand til hurtigt fjerne mikrober, samt døende celler. Derudover er de også involveret i regulering af udvikling af væv og reparation og opretholde homeostase1,2,3. Alle myeloide celler differentiere fra fælles myeloide stamceller i knoglemarven. Deres differentiering i mange funktionelt og morfologisk særskilt undersæt er i vid udstrækning kontrolleret af cytokiner og deres forskellige kombinationer af4. De mest intensivt undersøgt myeloide celle subsets omfatter neutrophilic granulocytter, makrofager og dendritiske celler. Fejl i nogen af disse befolkningsgrupper føre til potentielt livstruende konsekvenser og forårsage alvorlige dysfunktioner af immunsystemet hos mennesker og mus1,2,3,5, 6.
I modsætning til neutrophilic granulocytter, dendritiske celler og makrofager er bosiddende celler, væv og deres overflod i immun organer er relativt lavt. Som et resultat, er isolering og oprensning af primære dendritiske celler og makrofager for eksperimenter der kræver et stort antal af disse celler dyre og ofte umuligt. For at løse dette problem, er protokoller blevet udviklet for at opnå store mængder af homogen makrofager og dendritiske celler in vitro. Disse tilgange er baseret på differentiering af murine knoglemarv celler i overværelse af cytokiner: makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) til makrofager og granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand for dendritiske celler7,8,9,10,11,12. Celler genereret af denne metode er almindeligt beskrevet i litteraturen som knoglemarven afledt makrofager (BMDMs) og knoglemarv afledt dendritiske celler (BMDCs). De har flere fysiologiske egenskaber primære makrofager og dendritiske celler end med tilsvarende cellelinjer. En anden stor fordel er muligheden for at opnå disse celler form genetisk modificerede mus13. Sammenlignende studier mellem wild-type celler og celler, der stammer fra genmodificerede mus er ofte afgørende for afsløring roman funktioner af gener eller proteiner af interesse.
Analyse af subcellulært lokalisering af proteiner i levende celler kræver kobling af en fluorescerende etiket til protein af interesse i vivo. Dette sker oftest ved at udtrykke genetisk kodet fusion konstruktion består af en analyseret protein koblet (ofte via en kort linker) til en fluorescerende proteiner (fx., grøn fluorescerende proteiner (NGL))14,15 , 16. udtrykket af fluorescently mærket proteiner i dendritiske celler eller makrofager er udfordrende. Disse celler er generelt vanskeligt at transfect af standard Transfektion procedurer og effektivitetsgevinsterne tendens til at være meget lav. Desuden, Transfektion er forbigående, det genererer cellulært stress og opnåede intensiteten af fluorescens kan ikke være tilstrækkeligt for mikroskopi17. For at opnå en rimelig brøkdel af disse celler med en tilstrækkelig grad af transgenet udtryk, infektion af knoglemarv stamceller med retroviral er vektorer og deres efterfølgende differentiering af BMDMs eller BMDCs blevet en meget effektiv tilgang. Det er tilladt for analyse af proteiner af myeloide oprindelse i deres native cellulære miljø, både i en stabil tilstand eller i processer, der er kritiske for immunrespons fagocytose, immunologiske synapse dannelse eller migration. Her, beskriver vi en protokol, der giver mulighed for stabile udtryk af fluorescently mærket proteiner af interesse i murine knoglemarv afledt makrofager og dendritiske celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udtryk for protein af interesse i target-cellerne er et vigtigt skridt i mange typer af biologiske undersøgelser. Differentierede makrofager og dendritiske celler er vanskeligt at transfect af standard Transfektion og retroviral transduktion teknikker. Omgåelse Transfektion af disse differentierede celler med retroviral transduktion af knoglemarven progenitorceller, efterfulgt af differentiering, når de allerede bærer det ønskede konstruktion, er et kritisk skridt giver udtryk for ekstrauterin cDNAs i disse celletyp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tjekkiske Science Foundation (GACR) (projektnummer 16-07425S), af Charles University Grant agentur (GAUK) (projektnummer 923116) og af institutionel finansiering fra Institut for molekylær genetik, Academy of Sciences i tjekkiske Republik (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
