Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen
Summary
In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.
Abstract
Dendritische Zellen und Makrophagen sind wichtige Zellen, die die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger bilden. Sie spielen auch eine wichtige Rolle bei der Initiierung einer adaptiven Immunantwort. Experimenteller Arbeit mit diesen Zellen ist sehr anspruchsvoll. Ihre Fülle in Organen und Geweben ist relativ gering. Infolgedessen können nicht sie in großer Zahl isoliert werden. Sie sind auch schwer zu transfizieren mit cDNA-Konstrukten. Im Mausmodell können diese Probleme teilweise durch in Vitro Differenzierung von Knochenmark Vorläufern im Beisein von M-CSF für Makrophagen oder GM-CSF für dendritische Zellen überwunden werden. Auf diese Weise ist es möglich, große Mengen dieser Zellen von sehr wenigen Tieren zu erhalten. Darüber hinaus können Knochenmark Stammväter mit retroviralen Vektoren tragen cDNA-Konstrukte in frühen Phasen des Anbaus vor deren Differenzierung in Knochenmark abgeleitet dendritische Zellen und Makrophagen ausgestrahlt werden. So kann retrovirale Transduktion gefolgt von in-vitro- Differenzierung verwendet werden, verschiedene cDNA-Konstrukte in diesen Zellen zum Ausdruck bringen. Die Fähigkeit, ektopische Proteine deutlich auszudrücken reicht das Verbreitungsgebiet von Experimenten, die auf diese Zellen, einschließlich live Cell Imaging von fluoreszierenden Proteinen, Tandem Reinigungen für Interaktom Analysen, Struktur-Funktionsanalyse durchgeführt werden können, Überwachung der Zellfunktionen mit Biosensoren und viele andere. In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für retrovirale Transduktion von murinen Knochenmark abgeleitet dendritischen Zellen und Makrophagen mit Vektoren für Gewebekulturen getaggt Proteine codieren. Am Beispiel von zwei Adapter-Proteine, OPAL1 und PSTPIP2, zeigen wir die praktische Anwendung in Durchflusszytometrie und Mikroskopie. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen dieses Ansatzes.
Introduction
Myeloische Zellen sind einen unverzichtbaren Bestandteil unserer Abwehrmechanismen gegen Krankheitserreger. Sie sind in der Lage, schnell Mikroben sowie sterbenden Zellen zu beseitigen. Darüber hinaus engagieren sie sich auch bei der Regulierung der Gewebeentwicklung und Reparatur und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase1,2,3. Alle myeloische Zellen unterscheiden sich von gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark. Ihre Differenzierung in vielen funktionell und morphologisch unterschiedlichen Teilmengen ist zu einem großen Teil durch Zytokine und ihre verschiedenen Kombinationen4gesteuert. Die am intensivsten untersuchten myeloische Zelle Teilmengen sind Neutrophile Granulozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen. Mängel in keinem dieser Populationen führen zu potenziell lebensbedrohliche Konsequenzen und Ursache schweren Funktionsstörungen des Immunsystems bei Menschen und Mäusen1,2,3,5, 6.
Im Gegensatz zu Neutrophile Granulozyten dendritische Zellen und Makrophagen resident Gewebezellen und ihre Fülle im Immunsystem Organe ist relativ gering. Infolgedessen ist die Isolierung und Reinigung der primären dendritische Zellen und Makrophagen für Experimente erfordern eine große Anzahl dieser Zellen teuer und oft unmöglich. Um dieses Problem zu lösen, wurden Protokolle entwickelt, um große Mengen von homogenen Makrophagen oder dendritische Zellen in Vitrozu erhalten. Diese Ansätze basieren auf die Differenzierung der murinen Knochenmarkzellen in Anwesenheit von Zytokinen: Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) für Makrophagen und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) oder Flt3 Ligand für Dendritische Zellen7,8,9,10,11,12. Zellen, die von dieser Methode generiert werden häufig in der Literatur beschrieben, wie Knochenmark Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark dendritische Zellen (BMDCs abgeleitet). Sie haben mehr physiologische Eigenschaften gemeinsam mit primären Makrophagen oder dendritische Zellen als mit entsprechenden Zell-Linien. Ein weiterer großer Vorteil ist die Möglichkeit, diese Zellen bilden genetisch veränderter Mäuse13. Vergleichende Studien zwischen Wildtyp Zellen und Zellen aus genetisch veränderten Mäusen sind oft entscheidend für die Aufdeckung neuer Funktionen von Genen oder Proteinen von Interesse.
Analyse der subzellulären Lokalisierung der Proteine in lebenden Zellen erfordert die Kopplung eines fluoreszierenden Labels an das Protein des Interesses in Vivo. Dies geschieht am häufigsten durch genetisch codierte Fusion Konstrukt bestehend aus einer analysierten Protein (oft über einen kurzen Linker) gekoppelt an ein fluoreszierendes Protein zum Ausdruck zu bringen (zB., grün fluoreszierenden Proteins (GFP))14,15 , 16. der Ausdruck Eindringmittel tagged Proteine in dendritischen Zellen oder Makrophagen ist anspruchsvoll. Diese Zellen sind in der Regel schwer zu transfizieren standard Transfektion Verfahren und die Wirkungsgrade sind in der Regel sehr gering. Darüber hinaus die Transfektion ist flüchtig, es erzeugt zellulären Stresses und erreichten Intensität der Fluoreszenz ist möglicherweise nicht ausreichend für Mikroskopie17. Erlangung einen angemessenen Bruchteil dieser Zellen mit ein ausreichendes Maß an Transgene Ausdruck, die Infektion des Knochenmarks Vorläuferzellen mit retroviralen ist Vektoren und ihre anschließende Differenzierung in BMDMs oder BMDCs eine sehr effiziente geworden Ansatz. Es darf für die Analyse der Proteine myeloischen Ursprungs in ihrer natürlichen zellulären Umgebung, in einem stabilen Zustand oder bei Prozessen, die für die Immunantwort wie Phagozytose, immunologische Synapse Bildung oder Migration entscheidend sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, stabile Expression Eindringmittel tagged Proteine des Interesses an murine Knochenmark abgeleitet Makrophagen und dendritischen Zellen ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Ausdruck des Proteins des Interesses an Zielzellen ist ein wichtiger Schritt in vielen Arten von biologischen Studien. Differenzierte Makrophagen und dendritischen Zellen sind schwer zu transfizieren standard Transfektion und retrovirale Transduktion Techniken. Unter Umgehung der Transfektion von diesen differenzierten Zellen mit retrovirale Transduktion von Knochenmark Vorläufern, gefolgt von Differenzierung, wenn sie bereits das gewünschte Konstrukt tragen ist ein entscheidender Schritt, so dass des Ausdrucks der…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von tschechischen Science Foundation (GACR) (Projekt Nr. 16-07425S), von Charles University Grant Agency (GAUK) (Projekt-Nr. 923116) und durch die institutionelle Förderung vom Institut für molekulare Genetik, Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik unterstützt. Republik (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
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