במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז’ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.
תאים דנדריטי macrophages מכריע התאים היוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם גם לשחק תפקידים חשובים אתחול של תגובה חיסונית אדפטיבית. עבודה ניסיונית עם תאים אלה הוא מאתגר למדי. שפע שלהם איברים ורקמות הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, הם לא יכולים להיות מבודדים במספרים גדולים. הם גם שקשה transfect עם cDNA בונה. במודל מאתר, הבעיות הללו ניתן חלקית להתגבר על ידי במבחנה בידול של מח העצם אבות בנוכחות M-CSF עבור מקרופאגים או GM-CSF עבור תאים דנדריטים. בדרך זו, זה ניתן לקבל כמויות גדולות של תאים אלה מבעלי חיים מעט מאוד. יתר על כן, אבות מח העצם יכול להיות transduced עם וקטורים retroviral נושאת cDNA בונה בשלבים המוקדמים של טיפוח לפני שלהם התמיינות תאי דנדריטי מח עצם נגזר ואת macrophages. לפיכך, התמרה חושית retroviral ואחריו בידול במבחנה ניתן לבטא מבנים שונים cDNA בתאים אלה. היכולת לבטא באופן משמעותי חלבונים חוץ רחמי מרחיבה את טווח ניסויים שניתן לבצע על תאים אלה, כולל תא חי הדמיה של חלבונים פלורסנט, טנדם purifications עבור interactome ניתוחים, ניתוח מבנה פונקציה, ניטור של פונקציות הסלולר עם ביולוגיים ועוד רבים אחרים. במאמר זה, אנו מתארים עבור התמרה חושית retroviral של תאים דנדריטים מאתר מח עצם נגזר ו מקרופאגים פרוטוקול מפורט עם וקטורים קידוד חלבונים מתויג fluorescently. על הדוגמה של שני חלבונים מתאם, OPAL1, PSTPIP2, נדגים את היישום המעשי cytometry זרימה, מיקרוסקופ. נדון גם את היתרונות ואת המגבלות של גישה זו.
התאים מיאלואידית מייצגים חלק חיוני של מנגנוני ההגנה שלנו נגד פתוגנים. הם מסוגלים לחסל במהירות חיידקים, וכן תאים גוסס. בנוסף, הם גם מעורבים בוויסות התפתחות רקמת ותיקון ושמירה על הומאוסטזיס1,2,3. כל התאים מיאלואידית להבדיל אבות מיאלואידית נפוצים במח העצם. בידול שלהם לערכות מורפולוגית ושאיכות ברורים רבים היא במידה רבה נשלט על ידי ציטוקינים, שילובים שונים שלהם4. תת-קבוצות התאים מיאלואידית ביותר כוללים גרנולוציטים neutrophilic, המקרופאגים, תאים דנדריטים. פגמים בכל אוכלוסיות אלה להוביל להשלכות מסכני גורם חמור בתפקוד של מערכת החיסון אצל בני אדם ו עכברים1,2,3,5, 6.
בניגוד neutrophilic גרנולוציטים, התאים הדנדריטים ומקרופגים רקמת תאים תושב, שלהם שפע באיברים החיסון הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, בידוד של טיהור של תאים דנדריטים ראשיים ו מקרופאגים לניסויים הדורשים מספר גדול של תאים אלה הוא יקר ולא לעיתים קרובות בלתי אפשרי. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקולים פותחו כדי לקבל כמויות גדולות של מקרופאגים הומוגני או תאים דנדריטים בתוך חוץ גופית. גישות אלה מבוססים על הבידול בתאי מח עצם מאתר בנוכחות ציטוקינים: מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (M-CSF) עבור מקרופאגים, גורם מגרה המושבה גרנולוציט-מקרופאג (GM-CSF) או Flt3 ליגנד עבור תאים דנדריטים7,8,9,10,11,12. התאים שנוצר על ידי שיטה זו מתוארים בדרך כלל בספרות מקרופאגים (BMDMs) נגזר מח עצם, מח עצם נגזר תאים דנדריטים (BMDCs). יש להם עוד מאפיינים פיזיולוגיים במשותף עם מקרופאגים הראשי או תאים דנדריטים מאשר עם שורות תאים המתאימים. יתרון מרכזי נוסף הוא האפשרות לקבל טופס תאים אלה גנטית שונה עכברים13. לימודי השוואתי בין פראי-סוג תאים, התאים נגזר עכברים מהונדסים לעיתים קרובות הם קריטיים עבור פונקציות הרומן שיגורי של גנים או חלבונים עניין.
ניתוח של לוקליזציה subcellular של חלבונים בתאים חיים מחייב את צימוד של תווית פלורסנט החלבון של עניין אין ויוו. זו מושגת בדרך כלל על ידי הבעת לבנות פיוז’ן מקודדים גנטית מורכב של חלבונים שנותחה מצמידים (לעיתים קרובות באמצעות מקשר קצר) כדי חלבון פלואורסצנטי (למשל., ירוק (GFP) חלבון פלואורסצנטי)14,15 , 16. הביטוי של חלבונים מתויגות fluorescently תאים דנדריטים או מקרופאגים הוא מאתגר. תאים אלה הם בדרך כלל קשה transfect שגרות תקנים סטנדרטיים, היעילות נוטים להיות נמוכה מאוד. יתר על כן, תרביות תאים הוא חולף, זה יוצר מתח סלולארית, מושגת עוצמת קרינה פלואורסצנטית לא יהיה מספיק עבור מיקרוסקופ17. על מנת לקבל שבר סביר של תאים אלה לרמה מספקת של ביטוי transgene, הזיהום של מח העצם ובתאים עם retroviral וקטורים ובידול עוקבות שלהם לתוך BMDMs או BMDCs הפך להיות מאוד יעיל הגישה. זה איפשר לניתוח של החלבונים ממוצא מיאלואידית בסביבתם יליד הסלולר, הן במצב יציב, או במהלך התהליכים הם קריטיים עבור התגובה החיסונית כגון phagocytosis, היווצרות סינפסה אימונולוגי או העברה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ביטוי יציב של חלבונים מתויגות fluorescently עניין ב מאתר מח עצם נגזר מאקרופאגים תאים דנדריטים.
הביטוי של חלבונים עניין בתאי המטרה היא צעד מפתח בסוגים רבים של מחקרים ביולוגיים. תאים דנדריטים מאקרופאגים הבדיל קשים transfect על ידי תרביות תאים סטנדרטית וטכניקות retroviral התמרה חושית. דילוג על תרביות תאים תאים אלה עם retroviral התמרה חושית של אבות מח עצם, ואחריו בידול כאשר הם נושאים כבר הבונה הרצוי, …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הצ’כית המדע קרן (GACR) (פרויקט מספר 16-07425S), על ידי צ’ארלס אוניברסיטת גרנט סוכנות (גאוק) (מספר הפרוייקט 923116) ועל -ידי מוסדיים מימון מן המכון של הגנטיקה המולקולרית, האקדמיה למדעים הצ’כי הרפובליקה (RVO 68378050).
DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |