ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים
Summary
במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז’ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.
Abstract
תאים דנדריטי macrophages מכריע התאים היוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם גם לשחק תפקידים חשובים אתחול של תגובה חיסונית אדפטיבית. עבודה ניסיונית עם תאים אלה הוא מאתגר למדי. שפע שלהם איברים ורקמות הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, הם לא יכולים להיות מבודדים במספרים גדולים. הם גם שקשה transfect עם cDNA בונה. במודל מאתר, הבעיות הללו ניתן חלקית להתגבר על ידי במבחנה בידול של מח העצם אבות בנוכחות M-CSF עבור מקרופאגים או GM-CSF עבור תאים דנדריטים. בדרך זו, זה ניתן לקבל כמויות גדולות של תאים אלה מבעלי חיים מעט מאוד. יתר על כן, אבות מח העצם יכול להיות transduced עם וקטורים retroviral נושאת cDNA בונה בשלבים המוקדמים של טיפוח לפני שלהם התמיינות תאי דנדריטי מח עצם נגזר ואת macrophages. לפיכך, התמרה חושית retroviral ואחריו בידול במבחנה ניתן לבטא מבנים שונים cDNA בתאים אלה. היכולת לבטא באופן משמעותי חלבונים חוץ רחמי מרחיבה את טווח ניסויים שניתן לבצע על תאים אלה, כולל תא חי הדמיה של חלבונים פלורסנט, טנדם purifications עבור interactome ניתוחים, ניתוח מבנה פונקציה, ניטור של פונקציות הסלולר עם ביולוגיים ועוד רבים אחרים. במאמר זה, אנו מתארים עבור התמרה חושית retroviral של תאים דנדריטים מאתר מח עצם נגזר ו מקרופאגים פרוטוקול מפורט עם וקטורים קידוד חלבונים מתויג fluorescently. על הדוגמה של שני חלבונים מתאם, OPAL1, PSTPIP2, נדגים את היישום המעשי cytometry זרימה, מיקרוסקופ. נדון גם את היתרונות ואת המגבלות של גישה זו.
Introduction
התאים מיאלואידית מייצגים חלק חיוני של מנגנוני ההגנה שלנו נגד פתוגנים. הם מסוגלים לחסל במהירות חיידקים, וכן תאים גוסס. בנוסף, הם גם מעורבים בוויסות התפתחות רקמת ותיקון ושמירה על הומאוסטזיס1,2,3. כל התאים מיאלואידית להבדיל אבות מיאלואידית נפוצים במח העצם. בידול שלהם לערכות מורפולוגית ושאיכות ברורים רבים היא במידה רבה נשלט על ידי ציטוקינים, שילובים שונים שלהם4. תת-קבוצות התאים מיאלואידית ביותר כוללים גרנולוציטים neutrophilic, המקרופאגים, תאים דנדריטים. פגמים בכל אוכלוסיות אלה להוביל להשלכות מסכני גורם חמור בתפקוד של מערכת החיסון אצל בני אדם ו עכברים1,2,3,5, 6.
בניגוד neutrophilic גרנולוציטים, התאים הדנדריטים ומקרופגים רקמת תאים תושב, שלהם שפע באיברים החיסון הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, בידוד של טיהור של תאים דנדריטים ראשיים ו מקרופאגים לניסויים הדורשים מספר גדול של תאים אלה הוא יקר ולא לעיתים קרובות בלתי אפשרי. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקולים פותחו כדי לקבל כמויות גדולות של מקרופאגים הומוגני או תאים דנדריטים בתוך חוץ גופית. גישות אלה מבוססים על הבידול בתאי מח עצם מאתר בנוכחות ציטוקינים: מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (M-CSF) עבור מקרופאגים, גורם מגרה המושבה גרנולוציט-מקרופאג (GM-CSF) או Flt3 ליגנד עבור תאים דנדריטים7,8,9,10,11,12. התאים שנוצר על ידי שיטה זו מתוארים בדרך כלל בספרות מקרופאגים (BMDMs) נגזר מח עצם, מח עצם נגזר תאים דנדריטים (BMDCs). יש להם עוד מאפיינים פיזיולוגיים במשותף עם מקרופאגים הראשי או תאים דנדריטים מאשר עם שורות תאים המתאימים. יתרון מרכזי נוסף הוא האפשרות לקבל טופס תאים אלה גנטית שונה עכברים13. לימודי השוואתי בין פראי-סוג תאים, התאים נגזר עכברים מהונדסים לעיתים קרובות הם קריטיים עבור פונקציות הרומן שיגורי של גנים או חלבונים עניין.
ניתוח של לוקליזציה subcellular של חלבונים בתאים חיים מחייב את צימוד של תווית פלורסנט החלבון של עניין אין ויוו. זו מושגת בדרך כלל על ידי הבעת לבנות פיוז’ן מקודדים גנטית מורכב של חלבונים שנותחה מצמידים (לעיתים קרובות באמצעות מקשר קצר) כדי חלבון פלואורסצנטי (למשל., ירוק (GFP) חלבון פלואורסצנטי)14,15 , 16. הביטוי של חלבונים מתויגות fluorescently תאים דנדריטים או מקרופאגים הוא מאתגר. תאים אלה הם בדרך כלל קשה transfect שגרות תקנים סטנדרטיים, היעילות נוטים להיות נמוכה מאוד. יתר על כן, תרביות תאים הוא חולף, זה יוצר מתח סלולארית, מושגת עוצמת קרינה פלואורסצנטית לא יהיה מספיק עבור מיקרוסקופ17. על מנת לקבל שבר סביר של תאים אלה לרמה מספקת של ביטוי transgene, הזיהום של מח העצם ובתאים עם retroviral וקטורים ובידול עוקבות שלהם לתוך BMDMs או BMDCs הפך להיות מאוד יעיל הגישה. זה איפשר לניתוח של החלבונים ממוצא מיאלואידית בסביבתם יליד הסלולר, הן במצב יציב, או במהלך התהליכים הם קריטיים עבור התגובה החיסונית כגון phagocytosis, היווצרות סינפסה אימונולוגי או העברה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ביטוי יציב של חלבונים מתויגות fluorescently עניין ב מאתר מח עצם נגזר מאקרופאגים תאים דנדריטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הביטוי של חלבונים עניין בתאי המטרה היא צעד מפתח בסוגים רבים של מחקרים ביולוגיים. תאים דנדריטים מאקרופאגים הבדיל קשים transfect על ידי תרביות תאים סטנדרטית וטכניקות retroviral התמרה חושית. דילוג על תרביות תאים תאים אלה עם retroviral התמרה חושית של אבות מח עצם, ואחריו בידול כאשר הם נושאים כבר הבונה הרצוי, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הצ’כית המדע קרן (GACR) (פרויקט מספר 16-07425S), על ידי צ’ארלס אוניברסיטת גרנט סוכנות (גאוק) (מספר הפרוייקט 923116) ועל -ידי מוסדיים מימון מן המכון של הגנטיקה המולקולרית, האקדמיה למדעים הצ’כי הרפובליקה (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
