Murine अस्थि मज्जा में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज
Summary
इस अनुच्छेद में, हम murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । विधि retroviral के साथ अस्थि मज्जा progenitors के transduction पर आधारित है और इन विट्रो मेंमैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं में भेदभाव द्वारा पीछा किया ।
Abstract
वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज महत्वपूर्ण कोशिकाओं है कि रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कर रहे हैं । उंहोंने यह भी एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इन कोशिकाओं के साथ प्रयोगात्मक काम नहीं बल्कि चुनौतीपूर्ण है । अंगों और ऊतकों में इनकी बहुतायत अपेक्षाकृत कम होती है. नतीजतन, वे बड़ी संख्या में अलग नहीं किया जा सकता है । सीडीएनए के साथ transfect करना भी मुश्किल होता है । murine मॉडल में इन समस्याओं को आंशिक रूप से इन विट्रो में अस्थि मज्जा progenitors से मैक्रोफेज या जीएम वृक्ष कोशिकाओं के लिए सीएसएफ के लिए एम सीएसएफ की उपस्थिति में भेदभाव से दूर किया जा सकता है । इस तरह, यह बहुत कुछ जानवरों से इन कोशिकाओं की बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए संभव है । इसके अलावा, अस्थि मज्जा progenitors retroviral वैक्टर के साथ transduced किया जा सकता है खेती की प्रारंभिक अवस्था के दौरान सीडीएनए constructs ले जाने से पहले अपने विभेद करने के लिए अस्थि मज्जा व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज में । इस प्रकार, retroviral transduction इन विट्रो में भेदभाव द्वारा पीछा किया इन कोशिकाओं में विभिंन सीडीएनए निर्माण व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अस्थानिक प्रोटीन व्यक्त करने की क्षमता काफी प्रयोगों की सीमा है कि इन कोशिकाओं पर किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लाइव सेल इमेजिंग सहित, interactome विश्लेषण के लिए मिलकर शुद्धीकरण, संरचना समारोह का विश्लेषण प्रदान करता है, और कई अंय लोगों के साथ सेलुलर कार्यों की निगरानी । इस अनुच्छेद में, हम retroviral transduction के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज वैक्टर के लिए कोडिंग के साथ-प्रोटीन टैग की गईं । दो एडेप्टर प्रोटीन, OPAL1 और PSTPIP2 के उदाहरण पर, हम प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी में अपने व्यावहारिक अनुप्रयोग का प्रदर्शन । हम भी इस दृष्टिकोण के लाभों और सीमाओं पर चर्चा ।
Introduction
माइलॉयड कोशिकाओं रोगजनकों के खिलाफ हमारे रक्षा तंत्र का एक अनिवार्य हिस्सा प्रतिनिधित्व करते हैं । वे तेजी से रोगाणुओं को खत्म करने में सक्षम हैं, साथ ही मरने कोशिकाओं । इसके अलावा, वे भी ऊतक के विकास और मरंमत और homeostasis1,2,3को बनाए रखने में विनियमित करने में शामिल हैं । सभी माइलॉयड कोशिकाओं अस्थि मज्जा में आम माइलॉयड progenitors से अंतर । कई कार्यात्मक और आकृति विज्ञान अलग सबसेट में उनके भेदभाव एक बड़ी साइटोकिंस द्वारा नियंत्रित सीमा तक है और उनके विभिंन संयोजनों4। सबसे अधिक गहन अध्ययन माइलॉयड कोशिका उपसमुच्चय neutrophilic granulocytes, मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं में शामिल हैं । इन आबादियों में से किसी में दोष संभावित जीवन की धमकी परिणामों के लिए नेतृत्व और मानव और चूहों में प्रतिरक्षा प्रणाली के गंभीर रोग के कारण1,2,3,5, 6.
neutrophilic granulocytes के विपरीत, वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज ऊतक निवासी कोशिकाओं और प्रतिरक्षा अंगों में उनकी बहुतायत है अपेक्षाकृत कम है । नतीजतन, इन कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए प्राथमिक वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज के अलगाव और शुद्धि महंगा है और अक्सर असंभव है । इस समस्या को हल करने के लिए, प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में समरूप मैक्रोफेज या वृक्ष कक्षों में इन विट्रोप्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है । इन दृष्टिकोण साइटोकिंस की उपस्थिति में murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं के भेदभाव पर आधारित हैं: मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ) मैक्रोफेज और granulocyte के लिए-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) या Flt3 ligand के लिए वृक्ष कोशिकाओं7,8,9,10,11,12. इस विधि द्वारा उत्पन्न कोशिकाओं को सामान्यतः अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष कोशिकाओं (BMDCs) के रूप में साहित्य में वर्णित किया जाता है. वे प्राथमिक मैक्रोफेज या इसी सेल लाइनों के साथ की तुलना में वृक्ष कोशिकाओं के साथ आम में अधिक शारीरिक गुण है । एक अंय प्रमुख लाभ इन कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों13फार्म प्राप्त करने की संभावना है । जंगली प्रकार की कोशिकाओं और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से व्युत्पंन कोशिकाओं के बीच तुलनात्मक अध्ययन अक्सर जीन या ब्याज की प्रोटीन के उपंयास कार्यों को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का विश्लेषण vivo मेंरुचि के प्रोटीन के लिए एक फ्लोरोसेंट लेबल के युग्मन की आवश्यकता है । यह सबसे अधिक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्यूजन व्यक्त करने के द्वारा प्राप्त की है एक विश्लेषण प्रोटीन युग्मित (अक्सर एक लघु लिंक के माध्यम से) एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP))14,15 से बना निर्माण , 16. वृक्ष कोशिकाओं या मैक्रोफेज में फ्लोरोसेंट tagged प्रोटीन की अभिव्यक्ति चुनौतीपूर्ण है. इन कोशिकाओं को आम तौर पर मानक अभिकर्मक प्रक्रियाओं द्वारा transfect मुश्किल है और क्षमता के लिए बहुत कम हो जाते हैं । इसके अलावा, अभिकर्मक क्षणिक है, यह सेलुलर तनाव उत्पंन करता है और प्रतिदीप्ति की तीव्रता हासिल17माइक्रोस्कोप के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । आदेश में transgene अभिव्यक्ति के एक पर्याप्त स्तर के साथ इन कोशिकाओं का एक उचित अंश प्राप्त करने के लिए, अस्थि मज्जा जनक कोशिकाओं के retroviral वैक्टर और उनके बाद BMDMs या BMDCs में अंतर के साथ संक्रमण एक बहुत ही कुशल बन गया है दृष्टिकोण. यह अपने देशी सेलुलर वातावरण में माइलॉयड मूल के प्रोटीन के विश्लेषण के लिए अनुमति दी है, दोनों एक स्थिर राज्य में या प्रक्रियाओं है कि phagocytosis, प्रतिरक्षा synapse गठन या प्रवास के रूप में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं के दौरान. यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं में ब्याज की फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति की अनुमति देता है का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
लक्ष्य कोशिकाओं में रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति जैविक अध्ययन के कई प्रकार में एक महत्वपूर्ण कदम है । विभेदित मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं को मानक अभिकर्मक और retroviral transduction तकनीकों से transfect करना मुश्किल हो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चेक साइंस फाउंडेशन (GACR) (परियोजना संख्या 16-07425S) द्वारा समर्थित किया गया था, चार्ल्स विश्वविद्यालय अनुदान एजेंसी (गाउक) द्वारा (परियोजना संख्या ९२३११६) और आणविक आनुवंशिकी के संस्थान से संस्थागत धन द्वारा, चेक के विज्ञान अकादमी गणराज्य (RVO ६८३७८०५०) ।
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
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