Uttrykk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler og makrofager
Summary
I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for uttrykket av fluorescerende fusion proteiner i murine benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager. Metoden er basert på signaltransduksjon av benmarg progenitors med retroviral konstruksjoner etterfulgt av differensiering i makrofager og dendrittiske celler i vitro.
Abstract
Dendrittiske celler og makrofager er avgjørende celler som danner den første linjen i forsvaret mot patogener. De kan også spille viktige roller i initiering av en adaptiv immunrespons. Eksperimentelt arbeid med disse cellene er ganske utfordrende. Sin overflod i organer og vev er relativt lav. Som et resultat kan ikke de bli isolert i stort antall. De er også vanskelig å transfect med cDNA konstruksjoner. I murine modellen, kan disse problemene være delvis overvunnet av i vitro differensiering fra benmargen progenitors i nærvær av M-CSF for makrofager eller GM-CSF for dendrittiske celler. På denne måten er det mulig å få store mengder av disse cellene fra svært få dyr. Videre kan benmarg progenitors være transduced med retroviral vektorer bærer cDNA konstruksjoner i tidlige stadier av dyrking før deres differensiering inn benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager. Dermed kan retroviral signaltransduksjon etterfulgt av differensiering i vitro brukes til å uttrykke ulike cDNA konstruksjoner i disse cellene. Muligheten til å uttrykke ektopisk proteiner betydelig utvider utvalget av eksperimenter som kan utføres på disse cellene, inkludert levende celle imaging fluorescerende proteiner, tandem renselser for interactome analyser, struktur-funksjon analyser, overvåking av cellulære funksjoner med biosensors og mange andre. I denne artikkelen beskriver vi en detaljert protokoll for retroviral signaltransduksjon murine benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager med vektorer koding for fluorescently-merket proteiner. På eksempel på to adapter proteiner, OPAL1 og PSTPIP2, viser vi den praktiske anvendelsen i flowcytometri og mikroskopi. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger av denne tilnærmingen.
Introduction
Myeloide celler representerer en uunnværlig del av våre forsvarsmekanismer mot patogener. De kan raskt eliminere mikrober, samt døende celler. Dessuten, er de også involvert i å regulere vev utvikling og reparasjon og opprettholde homeostase1,2,3. Alle myeloide celler skille fra vanlige myelogen progenitors i beinmargen. Deres differensiering inn mange funksjonelt og morphologically forskjellige undergrupper er i stor grad kontrollert av cytokiner og deres ulike kombinasjoner4. De mest intensivt studerte myelogen celle undergrupper inkluderer neutrophilic granulocytter, makrofager og dendrittiske celler. Feil i noen av disse befolkningene føre til potensielt livstruende konsekvenser og forårsake alvorlige dysfunksjoner av immunsystemet hos mennesker og mus1,2,3,5, 6.
I motsetning til neutrophilic granulocytter, dendrittiske celler og makrofager vev bosatt celler og sin overflod i immun organer er relativt lav. Som et resultat, er isolasjon og rensing av primære dendrittiske celler og makrofager for eksperimenter krever et stort antall av disse cellene dyrt og ofte umulig. For å løse dette problemet, er protokollene utviklet for å få store mengder homogen makrofager eller dendrittiske celler i vitro. Disse metodene er avhengig av differensieringen murine beinmargen celleområde i nærvær av cytokiner: macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF) for makrofager og granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand for dendrittiske celler7,8,9,10,11,12. Celler generert av denne metoden er ofte beskrevet i litteraturen som benmarg avledet makrofager (BMDMs) og benmarg avledet dendrittiske celler (BMDCs). De har mer fysiologiske egenskaper til felles med primære makrofager eller dendrittiske celler enn med tilsvarende linjer. En annen stor fordel er muligheten for å få disse cellene danner genetisk endret mus13. Komparative studier mellom vill-type celler og celler avledet fra genmodifiserte mus er ofte avgjørende for avdekke romanen funksjoner av gener eller proteiner av interesse.
Analyse av subcellular lokalisering av proteiner i levende celler krever koblingen av en fluorescerende etikett til protein av interesse i vivo. Dette oppnås vanligvis ved å uttrykke genetisk kodet fusion konstruere består av en analysert protein kombinert (ofte via en kort linker) til et fluorescerende protein (f.eks., grønn fluorescerende protein (GFP))14,15 , 16. uttrykk for fluorescently merket proteiner i dendrittiske celler og makrofager er utfordrende. Disse cellene er generelt vanskelig å transfect standard hva prosedyrer og effektiviteten pleier å være svært lav. Videre til hva er forbigående, den genererer mobilnettet stress og oppnådd intensiteten av fluorescens kanskje ikke tilstrekkelig for mikroskopi17. For å oppnå en rimelig andel av disse cellene med et tilstrekkelig nivå av transgene uttrykk, infeksjon av benmarg progenitor celler med retroviral har vektorer og deres påfølgende differensiering inn BMDMs eller BMDCs blitt en svært effektiv tilnærming. Det lov for analyse av proteiner myelogen opprinnelse i deres eget mobilnettet miljø, både stabilt eller i prosesser som er kritiske for immunforsvaret som fagocytose, immunologiske synapse formasjon eller overføring. Her beskriver vi en protokoll som tillater stabil uttrykk for fluorescently merket proteiner av interesse i murine benmarg avledet makrofager og dendrittiske celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uttrykket protein interesse for målcellene er et viktig skritt i mange typer biologiske studier. Differensiert makrofager og dendrittiske celler er vanskelig å transfect av standard transfection og retroviral signaltransduksjon teknikker. Omgåelsen transfection av disse differensierte celler med retroviral signaltransduksjon av benmarg progenitors, etterfulgt av differensiering når de allerede bærer den ønskede konstruksjonen er et kritisk steg gir uttrykk for ektopisk cDNAs i disse celletyper. Et eksempel på vell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tsjekkiske Science Foundation (GACR) (prosjektnummer 16-07425S), av Charles University Grant Agency (GAUK) (prosjektnummeret 923116) og av institusjonelle finansiering fra Institutt for molekylær genetikk, Academy of Sciences i tsjekkiske Republikken (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
