Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos
Summary
Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.
Abstract
Macrófagos e células dendríticas são células cruciais que formam a primeira linha de defesa contra patógenos. Eles também desempenham papéis importantes no início de uma resposta imune adaptável. Trabalho experimental com estas células é bastante desafiador. Sua abundância em órgãos e tecidos é relativamente baixa. Como resultado, eles não podem ser isolados em grandes números. Eles também são difíceis de transfect com construções de cDNA. No modelo murino, estes problemas podem ser parcialmente superados por diferenciação em vitro de progenitores da medula óssea na presença de macrófagos de M-CSF ou GM-CSF para células dendríticas. Desta forma, é possível obter grandes quantidades dessas células de poucos animais. Além disso, os progenitores da medula óssea podem ser transfectadas com vetores retrovirais carregando do cDNA construções durante as fases iniciais de cultivo antes da sua diferenciação em células dendríticas derivada de medula óssea e macrófagos. Assim, a transdução retroviral seguida de diferenciação em vitro pode ser usada para expressar várias construções de cDNA nestas células. A habilidade de expressar proteínas ectópica substancialmente amplia a gama de experiências que podem ser executadas nessas células, incluindo a imagem de célula viva de proteínas fluorescentes, purificações em tandem para interactome análises, análises de estrutura-função, monitoramento de funções celulares com biosensores e muitos outros. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para retroviral transdução de murino medula óssea derivada de células dendríticas e macrófagos com vetores que codifica para proteínas fluorescente-etiquetadas. O exemplo de duas proteínas do adaptador, OPAL1 e PSTPIP2, vamos demonstrar sua aplicação prática em citometria de fluxo e microscopia. Também discutimos as vantagens e as limitações desta abordagem.
Introduction
Células mieloides representam uma parte indispensável dos nossos mecanismos de defesa contra patógenos. Eles são capazes de eliminar rapidamente os micróbios, bem como células morrendo. Além disso, também estão envolvidos na regulação da reparação e desenvolvimento do tecido e na manutenção da homeostase1,2,3. Todas as células mieloides diferenciarem dos progenitores mieloides comuns na medula óssea. Sua diferenciação em vários subconjuntos funcionalmente e morfologicamente distintos é em grande medida controlada por citocinas e suas várias combinações de4. Os subconjuntos de células mieloides mais intensivamente estudadas incluem neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas. Defeitos em qualquer dessas populações levam a consequências potencialmente fatais e causa graves disfunções do sistema imunológico em humanos e ratos1,2,3,5, 6.
Ao contrário de neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas são células residentes do tecido e sua abundância em órgãos imunes é relativamente baixa. Como resultado, o isolamento e purificação de primárias células dendríticas e macrófagos para experimentos que exigem um grande número dessas células é caro e muitas vezes impossível. Para resolver este problema, foram desenvolvidos protocolos para obter grandes quantidades de homogêneos macrófagos ou células dendríticas em vitro. Essas abordagens baseiam-se a diferenciação das células da medula murino na presença de citocinas: macrófago colônia-estimulando fator (M-CSF) por macrófagos e fator colônia-estimulando de granulócitos macrófagos (GM-CSF) ou Flt3 ligante para células dendríticas7,8,9,10,11,12. As células geradas por esse método são comumente descritas na literatura como medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e medula óssea derivadas de células dendríticas (BMDCs). Eles têm propriedades fisiológicas mais em comum com o primários macrófagos ou células dendríticas do que com linhas de célula correspondente. Outra grande vantagem é a possibilidade de obter estes formam células geneticamente modificadas ratos13. Comparativo de estudos entre o selvagem-tipo pilhas e células derivadas de camundongos geneticamente modificados são muitas vezes críticas para descobrindo novas funções dos genes ou proteínas de interesse.
Análise de Localização subcellular das proteínas nas células vivas requer o acoplamento de uma etiqueta fluorescente à proteína do interesse na vivo. Isto é conseguido mais comumente expressando a construção de fusão geneticamente codificado, composta por uma proteína analisada acoplada (geralmente através de um curto vinculador) a uma proteína fluorescente (EG., verde proteína fluorescente (GFP))14,15 , 16. a expressão de proteínas fluorescente etiquetadas em células dendríticas ou macrófagos é um desafio. Estas células são geralmente difíceis de transfect por procedimentos de transfeccao padrão e as eficiências tendem a ser muito baixa. Além disso, o transfection é transitório, ele gera estresse celular e alcançou a intensidade de fluorescência pode não ser suficiente para microscopia17. A fim de obter uma fração razoável destas células, com um nível suficiente de expressão do transgene, a infecção de células progenitoras de medula óssea com retroviral vetores e sua posterior diferenciação em BMDMs ou BMDCs tornou-se um muito eficiente abordagem. Isso permitiu a análise das proteínas de origem mieloide em seu ambiente nativo de celular, em um estado estável ou durante os processos que são críticos para a resposta imune, tais como a fagocitose, formação de sinapse imunológica ou migração. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a expressão estável de proteínas fluorescente etiquetadas um interesse de murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A expressão da proteína de interesse em células-alvo é uma etapa chave em muitos tipos de estudos biológicos. Diferenciada de macrófagos e células dendríticas são difíceis de transfect por transfecção padrão e técnicas de transdução retroviral. Ignorando o transfeccao dessas células diferenciadas com retroviral transdução da medula óssea progenitores, seguido de diferenciação, quando eles já carregam a construção desejada, é um passo crítico, permitindo a expressão dos cDNAs ectópica nestes t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Checa Science Foundation (GACR) (número do projeto 16-07425S), por Charles University Grant agência (SAUNG) (número do projeto 923116) e pelo financiamento institucional do Instituto de Genética Molecular, Academia de Ciências da República Checa República (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
