Выражение флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга-производные дендритные клетки и макрофаги
Summary
В этой статье мы предоставляем подробный протокол для выражения флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Метод основан на трансдукции костного прародителями с ретровирусной конструкции следуют дифференцировку в макрофаги и дендритные клетки в пробирке.
Abstract
Дендритные клетки и макрофаги являются важнейшим клетки, которые образуют первую линию обороны против патогенов. Они также играют важную роль в инициировании адаптивного иммунного ответа. Экспериментальная работа с этими клетками является довольно сложной задачей. Их численность в органах и тканях является относительно низким. В результате они не могут быть изолированы в больших количествах. Они также являются трудно transfect с cDNA конструкции. В мышиных модели в пробирке дифференциации от предшественники костного присутствии M-CSF для макрофаги или ГМ-КСФ для дендритных клеток можно частично преодолеть эти проблемы. Таким образом можно получить большое количество этих клеток от очень мало животных. Кроме того предшественники костного мозга может преобразованы с ретровирусной векторы нося cDNA конструкции ранних этапах выращивания до их дифференцировку в костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Таким образом ретровиральных трансдукции следуют дифференциации в пробирке может использоваться выразить различные конструкции cDNA в эти клетки. Способность выразить внематочная белки существенно расширяет спектр экспериментов, которые могут быть выполнены на эти клетки, включая живой клетки изображения флуоресцентных белков, тандем очищения для interactome анализа, анализа структуры функция, мониторинг клеточных функций с биодатчики и многие другие. В этой статье мы описываем подробный протокол для антиретровирусного лечения трансдукции мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги с векторами, кодирующих белки дневно тегами. На примере двух белков адаптер, OPAL1 и PSTPIP2, мы демонстрируем свое практическое применение в проточной цитометрии и микроскопии. Мы также обсудить преимущества и недостатки этого подхода.
Introduction
Миелоидных клеток являются неотъемлемой частью наших защитных механизмов против патогенов. Они способны быстро ликвидировать микробы, а также умирающие клетки. Кроме того они участвуют также в регулировании развития тканей и ремонта и в поддержании гомеостаза1,2,3. Все миелоидных клеток отличить от общих миелоидного предшественники костного мозга. В значительной степени контролируется цитокинов и их различные комбинации4является их дифференциация во многих морфологически и функционально различных подмножеств. Наиболее интенсивно изучали подмножеств миелоидных клеток включают нейтрофильных гранулоцитов, макрофаги и дендритные клетки. Дефекты в любой из этих групп населения приводят к потенциально угрожающих жизни последствий и причиной тяжелой дисфункции иммунной системы в организме человека и мышей1,2,3,5, 6.
В отличие от нейтрофильных гранулоцитов дендритные клетки и макрофаги-резидентов клетки тканей и их обилие в иммунных органов является относительно низким. В результате изоляция и очищение первичных дендритные клетки и макрофаги для экспериментов требующих большое количество этих клеток является дорогостоящей и зачастую невозможно. Для решения этой проблемы, были разработаны протоколы для получения большого количества однородных макрофаги и дендритные клетки в пробирке. Эти подходы основаны на дифференциацию клеток костного мозга мышиных присутствии цитокинов: макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) для макрофагов и гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) или Flt3 лигандом для дендритные клетки7,8,9,10,,1112. Клетки, созданный этим методом часто описаны в литературе, как костного производные макрофагов (BMDMs) и костного мозга, полученных дендритных клеток (BMDCs). Они имеют больше физиологические свойства общего первичного макрофаги или дендритные клетки чем с соответствующими клеточных линий. Другим большим преимуществом является возможность получения эти формы клетки генетически измененных мышей13. Сравнительные исследования между одичал тип клеток и клеток, полученных из генетически измененных мышей часто имеют решающее значение для раскрытия новых функций генов или протеинов интереса.
Анализ локализация внутриклеточных белков в живых клетках требует муфта флуоресцентные метки к протеину интереса в естественных условиях. Чаще всего это достигается путем выражения генетически закодированный фьюжн конструкция состоит из анализируемых белков, сочетании (часто через короткий компоновщика) к флуоресцентный белок (например., Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП))14,15 , 16. выражение дневно тегами белков в дендритные клетки и макрофаги является сложной задачей. Эти клетки обычно трудно transfect трансфекции стандартных процедур и эффективности, как правило, очень низкая. Кроме того transfection является временным, он генерирует клеточного стресса и достигнутые интенсивность флуоресценции не может быть достаточным для микроскопии17. Для того, чтобы получить разумную долю этих клеток с достаточным уровнем экспрессии трансген, инфекции прогениторных клеток костного мозга с антиретровирусной векторов и их последующее дифференцировку в BMDMs или BMDCs стал весьма эффективным подход. Это позволило для анализа белков миелоидного происхождения в их родной среде сотовой, так в стабильном состоянии, или в ходе процессов, которые являются критическими для иммунного ответа как фагоцитоз, иммунологические синапса формирования или миграции. Здесь мы описываем протокол, который обеспечивает стабильное выражение дневно тегами протеинов интереса в мышиных костного мозга, полученных макрофаги и дендритные клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выражение протеина интереса к клеткам-мишеням является ключевым шагом во многих видах биологических исследований. Трудно transfect стандартных transfection и антиретровирусным трансдукции методы дифференцированной макрофаги и дендритные клетки. Обход трансфекции этих дифференцированных кле…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана на Чешской науки фонд (GACR) (проект № 16-07425S), Карлова университета гранта Агентства (ГАУК) (номер 923116 проекта) и институционального финансирования от Института молекулярной генетики, Академия наук Чешской Республики Республика (РВО 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
