Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos
Summary
En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.
Abstract
Macrófagos y células dendríticas son células cruciales que forman la primera línea de defensa contra patógenos. También juegan papeles importantes en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa. Trabajo experimental con estas células es más bien un desafío. Su abundancia en órganos y tejidos es relativamente baja. Como resultado, no puede ser aislados en grandes cantidades. También son difíciles de transfectar con construcciones de cDNA. En el modelo murino, estos problemas pueden superarse parcialmente por en vitro la diferenciación de progenitores de médula ósea en presencia de M-CSF para macrófagos GM-CSF de las células dendríticas. De esta manera, es posible obtener grandes cantidades de estas células de muy pocos animales. Por otra parte, progenitores de médula ósea pueden ser transduced con vectores retrovirales que construcciones de cDNA durante etapas tempranas del cultivo antes de su diferenciación en la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos. Por lo tanto, transducción retroviral seguida de diferenciación en vitro puede utilizarse para expresar diversas construcciones de cDNA en estas células. La habilidad de expresar proteínas ectópicas substancialmente amplía la gama de experimentos que se pueden realizar en estas células, incluyendo células vivas imágenes de proteínas fluorescentes, purificaciones de tándem para interactoma análisis, análisis de la estructura y función, seguimiento de las funciones celulares con biosensores y muchos otros. En este artículo, describimos un protocolo detallado para la transducción retroviral de murino la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos con vectores que codifica para las proteínas con etiqueta fluorescente. En el ejemplo de dos proteínas, OPAL1 y PSTPIP2, demostramos su aplicación práctica en microscopia y citometría de flujo. También discutimos las ventajas y limitaciones de este enfoque.
Introduction
Las células mieloides representan una parte imprescindible de nuestros mecanismos de defensa contra patógenos. Son capaces de rápidamente eliminar microbios, así como las células moribundas. Además, también están involucrados en la regulación de la reparación y desarrollo de tejido y en el mantenimiento de la homeostasis1,2,3. Todas las células mieloides se diferencian de la común progenitores mieloides de la médula ósea. Su diferenciación en muchos subconjuntos funcionalmente y morfológicamente distintos es en gran parte controlada por citoquinas y sus diversas combinaciones4. Los subconjuntos de células mieloides más intensamente estudiadas son granulocitos, macrófagos y células dendríticas. Defectos en cualquiera de estas poblaciones llevan a consecuencias potencialmente peligrosas para la vida y causa graves disfunciones del sistema inmunitario en humanos y ratones1,2,3,5, 6.
A diferencia de los granulocitos, macrófagos y células dendríticas son células residentes del tejido y su abundancia en los órganos inmunes es relativamente baja. Como resultado, el aislamiento y purificación de primarias células dendríticas y macrófagos para experimentos que requieren un gran número de estas células es costoso y a menudo imposible. Para resolver este problema, se han desarrollado protocolos para obtener grandes cantidades de homogéneos macrófagos o células dendríticas in vitro. Estos enfoques se basan en la diferenciación de células de médula ósea murina en presencia de citoquinas: factor de estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) de macrófagos y el factor colonia-estimulante del granulocyte-macrófago (GM-CSF) o el ligando Flt3 para 8,7,9,10,de las células dendríticas de11,12. Células generadas por este método comúnmente se describen en la literatura como la médula ósea derivados de macrófagos (BMDMs) y la médula ósea derivados de células dendríticas (BMDCs). Tienen propiedades fisiológicas más en común con primarios macrófagos o células dendríticas que con líneas celulares correspondientes. Otra gran ventaja es la posibilidad de obtener estos forman células genéticamente modificados ratones13. Estudios comparativos entre las células de tipo salvaje y las células derivadas de ratones genéticamente modificados son a menudo críticas para descubrir nuevas funciones de genes o proteínas de interés.
Análisis de la localización subcelular de las proteínas en las células vivas requiere el acoplamiento de una etiqueta fluorescente de la proteína de interés en vivo. Esto comúnmente se logra expresando construcción genéticamente codificados fusión compuesta por una proteína analizada juntada (a menudo vía un enlazador corto) a una proteína fluorescente (por ej., proteína fluorescente (GFP) de verde)14,15 , 16. la expresión de fluorescencia etiquetas proteínas en las células dendríticas o macrófagos es un reto. Estas células son generalmente difíciles de transfectar por procedimientos estándar de la transfección y la eficiencia tiende a ser muy baja. Por otra parte, la transfección es transitoria, genera estrés celular y alcanzado intensidad de la fluorescencia puede no ser suficiente para microscopia17. Para obtener una fracción razonable de estas células con un suficiente nivel de expresión de transgenes, la infección de células progenitoras de médula ósea con retroviral vectores y su posterior diferenciación en BMDMs o BMDCs se ha convertido en un muy eficiente enfoque. Ha permitido el análisis de las proteínas de origen mieloide en su entorno celular nativo, en un estado estacionario o en procesos que son críticos para la respuesta inmune tales como fagocitosis, formación de la sinapsis inmunológica o migración. Aquí, describimos un protocolo que permite la expresión estable de fluorescencia etiquetas proteínas de interés en murinos la médula ósea derivado de macrófagos y células dendríticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La expresión de la proteína de interés en las células Diana es un paso clave en muchos tipos de estudios biológicos. Diferenciados de los macrófagos y las células dendríticas son difíciles de transfectar, transfección estándar y técnicas de transducción retroviral. Pasando por alto la transfección de las células diferenciadas con transducción retroviral de progenitores de médula ósea, seguido por la diferenciación cuando ya llevan la construcción deseada, es un paso crítico que permite la expresión …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Checa ciencia Fundación (GACR) (proyecto número 16-07425S), por Charles University Grant agencia (poesías) (número de proyecto 923116) y por fondos institucionales desde el Instituto de Genética Molecular de la Academia de Ciencias de la República Checa República (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
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