Uttryck för fluorescerande fusionsproteinerna i murina benmärg-derived dendritiska celler och makrofager
Summary
I denna artikel ger vi ett detaljerat protokoll för uttrycket av fluorescerande fusionsproteinerna i murina benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager. Metoden är baserad på transduktion av benmärg föräldraparets med retrovirala konstruktioner följt av differentiering till makrofager och dendritiska celler in vitro.
Abstract
Dendritiska celler och makrofager är avgörande celler som bildar den första försvarslinjen mot patogener. De kan också spela viktiga roller i inledandet av ett adaptivt immunsvar. Experimentellt arbete med dessa celler är ganska utmanande. Deras överflöd i organ och vävnader är relativt låg. Som ett resultat, kan inte de isoleras i stort antal. De är också svårt att transfect med cDNA konstruktioner. I murina modellen, kan dessa problem delvis övervinnas genom in vitro- differentiering från benmärgen stamfäder i närvaro av M-CSF för makrofager eller GM-CSF för dendritiska celler. På detta sätt är det möjligt att få stora mängder av dessa celler från mycket få djur. Dessutom kan benmärgen föräldraparets vara sensorik med retrovirala vektorer bära cDNA konstruktioner under tidiga stadier av odling före deras differentiering till benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager. Retrovirala transduktion följt av differentiering in vitro- kan således användas för att uttrycka olika cDNA konstruktioner i dessa celler. Förmågan att uttrycka ektopisk proteiner avsevärt utökar räckvidden för experiment som kan utföras på dessa celler, inklusive levande cell avbildning av fluorescerande proteiner, tandem reningar för interactome analyser, struktur och funktion analyser, övervakning av cellulära funktioner med biosensorer och många andra. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för retrovirala transduktion murina benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager med vektorer som kodar för proteiner som fluorescently-taggade. Exemplet med två adapter proteiner, OPAL1 och PSTPIP2, bevisa vi dess praktiska tillämpning i flödescytometri och mikroskopi. Vi diskuterar också fördelarna och begränsningarna med denna metod.
Introduction
Myeloida celler utgör en oumbärlig del av vår försvarsmekanismer mot patogener. De har möjlighet att snabbt eliminera mikrober, liksom döende celler. Dessutom, är de också involverade i regleringen av vävnad utveckling och reparation och att upprätthålla homeostas1,2,3. Alla myeloida celler skilja från vanliga myeloida i benmärgen. Deras differentiering till många funktionellt och morfologiskt skilda grupper är i stor utsträckning kontrolleras av cytokiner och deras olika kombinationer4. Mest intensivt studerade myeloida cell delmängder inkluderar neutrofila granulocyter, makrofager och dendritiska celler. Defekter i någon av dessa populationer leda till potentiellt livshotande konsekvenser och orsaka svår dysfunktioner av immunsystemet hos människor och möss1,2,3,5, 6.
Till skillnad från neutrofila granulocyter, dendritiska celler och makrofager är vävnad bosatt celler och deras överflöd i immun organ är relativt låg. Som ett resultat, är isolering och rening av primära dendritiska celler och makrofager för experiment som kräver ett stort antal av dessa celler dyra och ofta omöjligt. För att lösa problemet, har protokoll utvecklats för att få stora mängder homogen makrofager och dendritiska celler in vitro. Dessa metoder är baserade på differentieringen av murina benmärgsceller i närvaro av cytokiner: makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (M-CSF) för makrofager och granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand för dendritiska celler7,8,9,10,11,12. Celler som genereras av denna metod beskrivs ofta i litteraturen som benmärg härrör makrofager (BMDMs) och benmärg härrör dendritiska celler (BMDCs). De har mer fysiologiska egenskaper gemensamt med primära makrofager och dendritiska celler än med motsvarande cell linjer. En annan stor fördel är möjligheten att få dessa celler bildar genetiskt modifierade möss13. Jämförande studier mellan vildtyps-celler och celler som härrör från genetiskt modifierade möss är ofta avgörande för avslöjande roman funktioner av gener eller proteiner av intresse.
Analysen av subcellulär lokalisering av proteiner i levande celler kräver kopplingen av en fluorescerande etikett till proteinet av intresse i vivo. Detta uppnås vanligen genom att uttrycka genetiskt kodade fusion konstruktion består av en analyserade protein tillsammans (ofta via en kort länkare) till ett fluorescerande protein (t.ex., grönt fluorescerande protein (GFP))14,15 , 16. uttrycket av fluorescently märkta proteiner i dendritiska celler eller makrofager är utmanande. Dessa celler är generellt svåra att transfect av standard transfection förfaranden och effektivitetsvinsterna tenderar att vara mycket låg. Dessutom transfection är övergående, det genererar cellulär stress och uppnådda intensiteten av fluorescens kan inte räcka för mikroskopi17. För att få en rimlig andel av dessa celler med en tillräcklig nivå av transgenens uttryck, infektionen av benmärg stamceller med retrovirala har vektorer och deras efterföljande differentiering till BMDMs eller BMDCs blivit en mycket effektiv tillvägagångssätt. Det är tillåtet för analys av proteinerna av myeloisk ursprung i deras infödda cellulära miljön, både i ett stabilt tillstånd eller under processer som är kritiska för immunsvar som fagocytos, immunologisk synaps bildandet eller migration. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter stabil uttrycket av fluorescently märkta proteiner intresset murina benmärgen härrör makrofager och dendritiska celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uttrycket av protein sevärdheter i målceller är ett viktigt steg i många typer av biologiska studier. Differentierade makrofager och dendritiska celler är svåra att transfect av standard transfection och retrovirala transduktion tekniker. Förbi transfection dessa differentierade celler med retrovirala transduktion av benmärgen progenitorceller, följt av differentiering när de redan bär den önskvärda bygga, är ett viktigt steg så att uttrycket av ektopisk cDNAs i dessa celltyper. Ett exempel på framgångsr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av tjeckiska Science Foundation (GACR) (projektnummer 16-07425S), av Charles universitet Grant byrån (GAUK) (projektnummer 923116) och av institutionell finansiering från Institutet för molekylär genetik, akademin av vetenskaper av tjeckiska Republiken (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
