Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade
Summary
Bu makalede, biz fare kemik iliğinde floresan füzyon proteinlerin ifade için detaylı bir protokol dendritik hücreleri ve makrofajlar elde sağlar. Bu yöntem dayanır kemik iliği iletim üzerinde ataları ile retroviral yapıları farklılaşma içine makrofajlar tarafından izlenen ve dendritik hücreleri vitro.
Abstract
Dendritik hücreleri ve makrofajlar patojenlere karşı savunma ilk satırı oluşturan önemli hücrelerdir. Onlar da edinilmiş bağışıklık yanıtının başlama önemli rol oynarlar. Bu hücreler ile deneysel çalışma oldukça zordur. Onların bereket organ veya doku nispeten azdır. Sonuç olarak, onlar çok sayıda izole edemem. Onlar da cDNA yapıları ile transfect zordur. Fare modelinde, bu sorunların kısmen vitro farklılaştırma üzerinden M-CSF makrofajlar için veya GM-CSF dendritik hücreler için huzurunda kemik iliği ataları tarafından aşılabilir. Bu şekilde, bu hücreler büyük miktarda çok az hayvanlardan elde etmek mümkündür. Ayrıca, kemik iliği ataları cDNA yapıları ekimi onların farklılaşma kemik iliği türetilmiş dendritik hücreleri ve makrofajlar içine önce erken aşamalarında taşıyan retroviral vektörler ile transduced. Böylece, farklılaşma vitro tarafından takip retroviral iletim bu hücrelerde çeşitli cDNA yapıları ifade etmek için kullanılabilir. Ektopik proteinler önemli ölçüde hızlı yeteneği canlı hücre görüntüleme floresan proteinlerin, tandem purifications interactome analizleri, yapı-fonksiyon analizleri de dahil olmak üzere bu hücreler üzerinde gerçekleştirilen deneyler aralığı genişletir, biyosensörler ve diğerleri ile hücresel fonksiyonların izleme. Bu makalede, vektörel çizimler fluorescently öğesini proteinler için kodlama ile fare kemik iliği türetilmiş dendritik hücreleri ve makrofajlar retroviral iletim için detaylı bir protokol açıklamak. İki adaptör protein, OPAL1 ve PSTPIP2, örnek üzerinde Akış Sitometresi ve mikroskopi pratik uygulaması gösterilmektedir. Biz de avantaj ve sınırlamalar bu yaklaşımın tartışıyorlar.
Introduction
Myeloid hücrelerin patojenlere karşı savunma mekanizmaları vazgeçilmez bir parçası temsil eder. Onlar hızla mikroplar, hem de ölen hücreleri ortadan kaldırmak mümkündür. Buna ek olarak, onlar da doku gelişimi ve onarım düzenlenmesinde ve homeostasis1,2,3korumak yer alırlar. Kemik iliğinde ortak miyeloid ataları myeloid hücrelerin tümünü ayırt. Pek çok işlevsel ve morfolojik ayrı alt kümeleri içine onların farklılaşma sitokinler ve onların çeşitli kombinasyonları4tarafından kontrol edilen büyük ölçüde etmektir. Çalışılmış en myeloid hücre alt kümeleri nötrofilik granülosit, makrofajlar ve dendritik hücreleri içerir. Bu nüfusun herhangi bir kusurları sonuçları potansiyel olarak yaşamı tehdit eden ve neden ciddi işlev bozuklukları insan ve fare1,2,3,5, , bağışıklık sisteminin yol 6.
Nötrofilik granülosit, aksine dendritik hücreleri ve makrofajlar doku ikamet hücreleri ve bağışıklık organlarında kendi bereket nispeten düşük. Sonuç olarak, yalıtım ve arıtma birincil dendritik hücreleri ve makrofajlar bu hücreler çok sayıda gerektiren deneyler için pahalı ve sık sık imkansız. Bu sorunu çözmek için iletişim kuralları homojen makrofajlar veya dendritik hücreler içinde vitrobüyük miktarda elde etmek için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar sitokinler huzurunda fare kemik iliği hücrelerinin farklılaşması üzerine dayanır: makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) makrofajlar ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) veya Flt3 ligand için için dendritik hücreler7,8,9,10,11,12. Bu yöntemle üretilen hücreler yaygın olarak kemik iliği makrofajlar (BMDMs) elde edilen ve kemik iliği dendritik hücreler (BMDCs) elde edilen literatürde açıklanmıştır. Onlar daha fazla fizyolojik özellikleri ile ortak birincil makrofajlar veya karşılık gelen hücre hatları ile dendritik hücreler daha vardır. Bu hücreler formu genetik olarak elde etme olasılığını fareler13değiştiren başka bir büyük avantaj sağlıyor. Vahşi tipi hücreler arasında karşılaştırmalı çalışmalar ve genetiği değiştirilmiş fare türetilmiş hücre kez genlerin ortaya çıkarılması roman işlevleri veya ilgi proteinler için önemlidir.
Canlı hücreler proteinlerin hücre altı yerelleştirme analiz faiz vivo içindeprotein flüoresan etiket bağlantı gerektirir. Bu en sık (sık sık bir kısa bağlayıcı) birleştiğinde bir analiz protein flüoresan bir protein oluşan genetik olarak kodlanmış füzyon yapı ifade ederek elde edilir (Örn., yeşil flüoresan protein (GFP))14,15 , 16. dendritik hücreler veya makrofajlar fluorescently tagged proteinler zorlu ifadesidir. Bu hücreler genellikle standart transfection yordamlar tarafından transfect zordur ve verimliliği çok düşük olma eğilimindedir. Ayrıca, transfection geçici, hücresel stres oluşturur ve elde yoğunluğunu floresans mikroskobu17için yeterli olmayabilir. Bu hücreler makul bir kısmını transgene ifade, enfeksiyon kemik iliği progenitör hücre retroviral ile yeterli bir düzeyde elde etmek için vektörel çizimler ve onların sonraki farklılaşma BMDMs veya BMDCs haline gelmiştir çok etkili yaklaşım. Kendi yerel hücresel ortamında, fagositoz, immünolojik synapse oluşumu veya geçiş gibi bağışıklık yanıtı için kritik olan işlemleri sırasında veya bir sabit durumda miyeloid kökenli proteinlerin analiz için izin verdi. Burada, biz fare kemik iliği türetilmiş makrofaj ve dendritik hücreler ilgi fluorescently tagged proteinlerin istikrarlı ifade sağlayan bir protokol tanımlamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Faiz hedef hücrelerdeki protein önemli bir adım biyolojik çalışmalar birçok türde ifadesidir. Farklılaştırılmış makrofaj ve dendritik hücreler retroviral iletim teknikleri ile standart transfection transfect zordur. Bu farklılaşmış hücreler transfection kemik iliği ataları, onlar zaten istenen yapı taşır farklılaşma tarafından takip retroviral iletim ile atlayarak ektopik cDNAs ifade bunları sağlayan kritik bir adımdır hücre tipleri. Bu yöntemin başarılı kullanım örneği bizim son y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tarafından Çek Bilim Vakfı (GACR) (proje numarası 16-07425S), Charles Üniversitesi Grant Ajansı (Saung) (proje numarası 923116) tarafından ve kurumsal finansman Enstitüsü, moleküler genetik üzerinden, Çek Bilimler Akademisi tarafından desteklenen Cumhuriyeti (RVO 68378050).
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
References
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
- Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
- Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
- Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
- Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
- Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
- Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
- Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
- Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
- Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
- Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
- Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
- Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
- McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
