In Vitro Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi

Summary

Vi beskriver metoder for å isolere hjørnetann nøytrofile fra hele blod og visualisere netto formasjon i live nøytrofile bruker fluorescens mikroskopi. Også beskrevet er protokoller å kvantifisere netto dannelse og citrullinated histone H3 (citH3) uttrykk med immunofluorescence mikroskopi.

Abstract

Svar på invaderende patogener, slipp nøytrofile nøytrofile ekstracellulære feller (nett), som er ekstracellulære nettverk av DNA dekorert med histones og antimikrobielle proteiner. Overdreven netto dannelse (NETosis) og citH3 utgivelse i sepsis er tilknyttet flere orgel dysfunksjon og dødelighet i mus og mennesker, men konsekvensene i hunder er ukjent. Her, beskriver vi en teknikk for å isolere hjørnetann nøytrofile fra fullblod for observasjon og kvantifisering av NETosis. Leukocytter-rich plasma, generert av dekstran sedimentering, deles av kommersielt tilgjengelig tetthet gradert separasjon media og granulocytter samlet antall og levedyktighet testing. For å observere sanntid NETosis i live nøytrofile, legges cellen permeant og celle impermeant fluorescerende nukleinsyre flekker til nøytrofile aktivert lipopolysakkarid (LPS) eller phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Endringer i kjernefysiske morfologi og netto formasjon er observert over tid ved fluorescens mikroskopi. In vitro NETosis er mer preget av co-colocalization av celle-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) og citrullinated histone H3 (citH3) bruker en modifisert dobbel-immunolabelling-protokoll. Å objektivt kvantifisere netto dannelse og citH3 uttrykk med fluorescens mikroskopi, garn og citH3-positive celler er kvantifisert på forblindet måte med tilgjengelig programvare. Denne teknikken er en bestemt analysen vurdere i vitro kapasiteten av hjørnetann nøytrofile å gjennomgå NETosis.

Introduction

Nøytrofile er kortvarige granulocytter ansvarlig for det første forsvaret mot invaderende patogener. Nøytrofile, rekruttert til området av smitte, eliminerer mikroorganismer fagocytose, omfatter degranulering og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS)¹. I nærvær av bakterier eller endotoxins dekorert nøytrofile utgivelsen nøytrofile ekstracellulære feller (nett), består av ekstracellulære chromatin med histones og detaljert proteiner som elastase og myeloperoxidase (MPO)². Selv om garn har uunnværlig antimikrobielle egenskaper, antyder øke experimental og klinisk bevis at overivrig netto formasjon under sepsis kan føre til flere orgel dysfunksjon og død^{3,4, 5 , 6}.

Fordi garn kan spille en liknende patofysiologiske rolle i hunder, kan terapeutisk intervensjon som forhindre eller redusere netto formasjon tjene som ny behandling strategier i septisk dyr. Derfor er det behov for en pålitelig teknikk for å vurdere og kvantifisere NETosis og netto komponenter i hundene. NET komponenter, inkludert celle-gratis DNA (cfDNA) og nucleosomes har tidligere blitt evaluert i hjørnetann nøytrofile og plasma klinisk hundene^7,8,9. Bruker fluorescens analyser, fant Goggs og Letendre at septisk hunder har høyere nivåer av cfDNA enn rask hundene⁸. Selv om disse teknikkene er svært objektive og kvantitativ, er måling av cfDNA og nucleosomes som angir NETosis uspesifisert siden de kan utledes fra nekrotisk celler enn NETosing nøytrofile. Her beskriver vi en teknikk som bruker fluorescens mikroskopi for å undersøke atferd av live NETosing nøytrofile. Vi har også detalj en endret protokoll med dobbel-immunolabeling subjektivt kvantifisere garn og deres komponenter som MPO og citH3 i hjørnetann nøytrofile¹⁰.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of California, Davis (protokoll nummer: 18338). 1. blod samling Trekke 10 mL blod fra enten cephalic eller jugulare venen bruker en 21 G nål av sprøyte aspirasjon. For å unngå overdreven skjæring stress, fjerne nålen fra sprøyten før du overfører blod i lysrør som inneholder natrium heparin (75 USP). Forsiktig Inverter rør noen ganger å sikre tilstrekke…

Representative Results

Bruker denne protokollen, om levende celle bildebehandling, kan etterforskere observere kjernefysiske morfologi, plasma membranen integritet og tilstedeværelsen av cfDNA i levende nøytrofile. En celle impermeant kjernefysiske fargestoffet flekker kjerner syrer rød i celler med skadede. En annen celle-permeant fargestoff, etiketter intracellulær nucleic syrer i levende celler med intakt plasma membraner. Alle intakt nøytrofile, uansett deres behandlinger, bør vises grønne og viser k…

Discussion

Vi presenterer her en protokoll for å observere endringene i kjerner conformation og cfDNA utgivelse i levende hjørnetann nøytrofile med både en celle permeant fargestoff og en celle impermeant fargestoff. Den største fordelen med denne analysen er at det tillater for sanntids deteksjon av netto dannelsen av høy oppløsning mikroskopi i live nøytrofile uten celle fiksering, derfor gir et enkelt og nyttig verktøy for å observere i vitro netto formasjon. Siden denne analysen ikke krever antistoffer for p?…

Materials

Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306