In Vitro Differentiering av mus granulocyt-makrofag-granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF)-celler T Helper (THGM)
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att skilja murina granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) celler från naiva CD4 + T-celler, inklusive isolering av naiva CD4 + T-celler, differentiering av THGM, och analys av differentierade THGM celler. Denna metod kan tillämpas på studier av förordningen och funktion av THGM celler.
Abstract
Den granulocyt-makrofag-granulocytkolonistimulerande faktorn (GM-CSF)-producerande T helper (THGM) cell är en nyligen identifierade T helper cell delmängd som huvudsakligen utsöndrar GM-CSF utan att producera interferon (IFN) γ eller interleukin (IL) -17 och finns att spela en viktig roll i de autoimmun neuroinflammation. En metod för isolering av naiva CD4 + T-celler från en enskild cell suspension av splenocytes och THGM cell generation från naiva CD4 + T-celler skulle vara en användbar teknik i studien av T-cell-medierad immunitet och autoimmuna sjukdomar. Här beskriver vi en metod som skiljer mus naiva CD4 + T-celler i THGM celler främjas av IL-7. Resultatet av differentieringen bedömdes genom analys av cytokiner uttrycket med hjälp av olika tekniker, inklusive intracellulära cytokin färgning kombinerade med flödescytometri, en kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (PCR), och Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Cirka 55% av cellerna med THGM differentiering-protokollet som beskrivs här, och uttryckte GM-CSF med en minimal uttryck av IFNα eller IL-17. Dominerande uttrycket av GM-CSF genom THGM celler bekräftades ytterligare analys av uttryck för GM-CSF, IFNα och IL-17 på både mRNA och protein nivåer. Således denna metod kan användas för att differentiera naiva CD4 + T-celler till THGM celler in vitro-, som kommer att vara användbar i studiet av THGM cellbiologi.
Introduction
CD4 + T helper (TH) celler är viktiga komponenter i immunsystemet, med avgörande roller i värd försvar mot mikrobiella patogener, i cancer surveillance, autoimmunitet1,2,3. Vid T-cell receptor (TCR) aktivering, naiva CD4 + T-celler kan differentieras i TH1, TH2, TH 17, eller regulatoriska T (Treg) celler under påverkan av olika cytokin FOI2,4, 5. nyligen en ny delmängd av TH celler, som huvudsakligen producerar GM-CSF, identifierades och heter THGM6. Differentiering av THGM celler drivs av IL-7 genom aktivering av en signal givare och en aktivator av transkription 5 (STAT5). Dessa celler uttrycker en stor mängd GM-CSF samtidigt ha ett lågt uttryck av andra TH-cell signatur cytokiner såsom IFNγ och IL-176. GM-CSF befanns spelar en avgörande roll i utvecklingen av CD4 + T cell-medierad neuroinflammation7,8. Jämfört med IFNγ – eller IL-17-uttryckande autoreaktiva T celler, celler GM-CSF-uttryckande T överförs till vildtyp (WT) möss orsakade en tidigare sjukdomsdebuten och högre sjukdomens svårighetsgrad. Dessutom misslyckades Csf2– / – T-celler att inducera experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) efter överförs adoptively till WT mottagare, medan T-celler saknar IFNγ eller IL-17A behållit förmågan att medla EAE7. Dessutom förbättras en blockad av GM-CSF med neutraliserande antikroppar EAE sjukdom svårighetsgrad8. Dessutom resulterade en brist på STAT5 i T-celler i möss i en minskad THGM generation, och därmed i ett motstånd av möss till EAE utveckling6. Dessa resultat understryker vikten av GM-CSF-uttryckande TH celler i autoimmuna neuroinflammatoriska sjukdomen. Således, att fastställa en metod för att skilja GM-CSF-uttryckande TH -celler från naiva CD4 + T-celler skulle vara viktigt i studien av patogenesen vid autoimmuna neuroinflammation och T cellmedierade immunsvaret. Men ett protokoll som effektivt genererar THGM celler från murina naiva CD4 + inte har fastställts.
Här presenterar vi en metod som skiljer murina THGM celler från naiva CD4 + T-celler. Det här protokollet beskriver hela förfarandet, inklusive utvinning av mjälte från musen, utarbetandet av en encellig suspension, CD4 positiva val, cellen fluorescens-aktiverat sortering (FACS) och cellen TH differentiering och analys. De differentierade T-hjälpare cellerna analyseras av intracellulära cytokin färgning kombinerade med flödescytometri att bestämma cytokin uttrycket på enskild cell nivå, genom en kvantitativ realtids-PCR att bestämma cytokin uttrycket på mRNA-nivå, och med ELISA att bedöma cytokin uttrycket på proteinnivå. Denna metod kan tillämpas på studier THGM cellbiologi under olika förhållanden, såsom EAE, där GM-CSF spelar en viktig roll i patogenesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs vi ett protokoll för en in vitro- THGM differentiering från mus naiva CD4 + celler, följt av en analys av differentierade cellerna att validera metoden. Notera, kan både mjälten och lymfkörtlarna användas för naiva CD4 + T cell rening och THGM differentiering. Cytokin uttrycket bestäms av intracellulära cytokin färgning kombinerat med flödescytometri som visade att ca 55% av cellerna förmåddes att bli GM-CSF-uttryckande celler på THGM villkor (<strong…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från National University Health System av Singapore (T1-2014 okt-12 och T1-2015 Sep-10).
Materials
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
