ويصف هذا البروتوكول الهندسة الوراثية عابر لطب الأسنان من الخلايا الجذعية المستخرجة من المسام الأسنان البشرية. الاستراتيجية التطبيقية التعديل غير الفيروسية التي قد تصبح أساسا لتحسين منتجات الخلايا الجذعية العلاجية.
وحتى الآن، العديد من أنواع الخلايا الجذعية في مراحل إنمائية مختلفة في التركيز على علاج الأمراض التنكسية. حتى الآن، جوانب معينة، مثل موت الخلية الأولى واسعة النطاق والآثار العلاجية منخفضة، ضعف الترجمة السريرية واسعة النطاق. الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية قبل زرع برزت كوسيلة واعدة لتحسين الآثار العلاجية من الخلايا الجذعية. ومع ذلك، تزال تفتقر إلى نظم إيصال الجينات آمنة وفعالة. ولذلك، تطوير أساليب مناسبة قد توفر نهجاً لحل التحديات الراهنة في العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية.
يصف هذا البروتوكول استخراج وتوصيف الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) كذلك على التحوير الوراثي غير الفيروسية. كشف النقاب عن المسام الأسنان بعد الولادة كمصدر واعدة ويمكن الوصول إليها بسهولة لحصاد الخلايا الجذعية البالغة multipotent تمتلك إمكانات عالية الانتشار. ويعرض إجراءات العزل وصف طريقة بسيطة وموثوق بها لحصاد هدفسكس من تأثير ضرس العقل. ويضم هذا البروتوكول أيضا أساليب لتحديد خصائص الخلايا الجذعية الخلايا المعزولة. للهندسة الوراثية من هدفسكس، يرد استراتيجية أمثل تعداء الأيوني على أساس المادة الدهنية مواتية ميكرورنا ذات كفاءة عالية مقدمة دون أن تسبب الآثار السامة للخلايا. ميكرورناس هي المرشحين المناسبين للتلاعب بالخلية عابرة، هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون خطر التكامل الجينوم مستقرة. وهكذا، يمثل هذا البروتوكول إجراء آمنة وتتسم بالكفاءة لهندسة هدفسكس التي يمكن أن تصبح مهمة لتحسين فعاليتها العلاجية.
جريب الأسنان البشرية فضفاضة المستمدة من اكتوميسينتشيمالي نسيج الضام المحيطة بالأسنان النامية1،2. إلى جانب وظيفتها تنسيق أوستيوكلاستوجينيسيس وتكون العظم لعملية اندلاع الأسنان، يأوي هذا النسيج الخلايا الجذعية، والسلف لا سيما لوضع دواعم3،،من45. ولذلك، يعتبر المسام الأسنان كمصدر بديل لحصاد الخلايا الجذعية البشرية6،7.
وأظهرت دراسات عدة أن الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) قادرون على التفريق في نسب اللثة بما في ذلك خلايا الاوستيوبلاستس، الرباط الليفية وسيمينتوبلاستس8،،من910 . وعلاوة على ذلك، عرضت هذه الخلايا تطابق خصائص كافة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بما في ذلك القدرات الذاتية تجديد، التقيد البلاستيك، والتعبير عن علامات سطح معين (مثل، CD73، CD90، CD105) كذلك، أوستيوجينيك، أديبوجينيك وتشوندروجينيك التمايز المحتملة11،،من1213. وكشفت دراسات أخرى أيضا إمكانية تفريق العصبية هدفسكس2،،من1415،16،،من1718.
نظراً لخصائص واعدة وسهولة الوصول، أصبح هدفسكس ذات الصلة مؤخرا للأنسجة الهندسة19،،من2021. الدراسات الأولى التي ركزت على إمكانات دفسكس لتجديد العظام واللثة وجذور الأسنان19،،من2223،24،،من2526، ،من 2728،،من2930. معرفة قدرة هدفسكس العصبية، تطبيقها كعلاج محتمل لأمراض الأعصاب منذ التحقيق31،،من3233. هدفسكس اكتسبت أيضا أهمية فيما يتعلق بتجديد أخرى34،الأنسجة (ظهارة القرنيةمثلاً )35. إمكانات العلاج هدفسك لا يقوم فقط على إمكاناتهم التمايز المباشر بل أيضا على نشاطهم باراكريني. مؤخرا، أظهرت أن تفرز ثروة عوامل النشطة بيولوجيا، مثل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وعامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (بفجف) ويشبه الأنسولين عامل النمو (IGF) النمو تتمثل هدفسكس عامل (هجف)، التي تقوم بدور حاسم للأوعية والمرباة وإعادة عرض مصفوفة الخلوية إضافية وعمليات الترميمي36.
ومع ذلك، تأثر الترجمة السريرية واسعة النطاق للعلاج بالخلايا الجذعية لا تزال العديد من التحديات، مثل موت الخلايا الأولية الضخمة وانخفاض الخلايا الجذعية مفيدة آثار37،38. الهندسة الوراثية يوفر استراتيجية واعدة للتصدي لهذه التحديات وذلك يمكن أن يعزز الفعالية العلاجية للخلايا الجذعية البالغة38،،من3940. للتلاعب بالخلية عابرة، ميكرورناس (ميرس) مرشحين مناسبين، كما هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون الخطر من الجينوم مستقرة التكامل41،42، 43-وحتى الآن، حددت عدة ميرس مفيدة تعزيز انتشار الخلايا الجذعية والبقاء على قيد الحياة، وصاروخ موجه، نشاط paracrine، فضلا عن على التمايز إلى عدة الأنساب44. على سبيل المثال، المهندسة مير-133a MSCs أظهرت زيادة البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت في قلوب الفئران إينفاركتيد أدى تحسين وظيفة القلب عند مقارنة بغير معدلة MSCs45. وبالمثل، عرضت مير-146a overexpressing MSCs لإفراز كميات أعلى من VEGF الذي أدى بدوره إلى تعزيز كفاءة علاجية في الأنسجة الدماغية46.
ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لاستخراج انتقائية والهندسة الوراثية من هدفسكس. ولهذا الغرض، وصفت لنا هضم الحصاد والانزيميه تجاويف الأسنان البشرية وكذلك عزل هدفسكس اللاحقة. لوصف الخلايا المعزولة، وتعليمات هامة لتحقق خصائص ماجستير قد أدرجت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها “الجمعية الدولية” “العلاج الخلوي”13. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للجيل من تعديل مير هدفسكس بتطبيق استراتيجية الأيوني تعداء على أساس المادة الدهنية وتقييم كفاءة تعداء وسيتوتوكسيسيتي.
الخلايا الجذعية البالغة حاليا في التركيز لمعالجة العديد من الأمراض التنكسية. على وجه الخصوص، العظام نخاع (بي أم)-المستمدة من الخلايا الجذعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) و MSCs، قيد التحقيق السريرية مكثف47. ومع ذلك، حصاد BM هو إجراء جائر تسبب الألم في موقع التبرع و…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل “البرنامج فورون المركز الطبي الجامعي روستوك” (889018) ومؤسسة رطبة (2016-11). وبالإضافة إلى ذلك، بعد الظهر، والثالثة التي يدعمها الفدرالية (كبار الشخصيات + 00240).
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
ZEN2011 software | Zeiss | ||
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |