该协议描述了从人毛囊中提取的牙干细胞的瞬态基因工程。应用的非病毒性修饰策略可以为治疗性干细胞产品的改进奠定基础。
迄今为止, 不同发育阶段的几种干细胞类型是治疗退行性疾病的重点。然而, 某些方面, 如最初的大规模细胞死亡和低治疗效果, 损害了他们广泛的临床翻译。移植前干细胞基因工程是优化治疗性干细胞效应的一种有前途的方法。然而, 仍然缺乏安全和有效的基因传递系统。因此, 开发合适的方法可以为解决目前干细胞疗法中的挑战提供一种途径。
本协议描述了人类牙囊干细胞 (hdfsc) 的提取和表征及其非病毒遗传修饰。产后毛囊公布, 作为一个有希望的和容易获得的来源, 收获具有高增殖潜力的成人多能干细胞。所述的隔离过程提供了一种简单可靠的方法来从受影响的智齿中获取 hdfsc。该协议还包括定义分离细胞干细胞特性的方法。对于 hdfsc 的基因工程, 提出了一种优化的阳离子脂质转染策略, 可在不产生细胞毒性影响的情况下实现高效的微 rna 导入。微 rna 是瞬态细胞操作的合适选择, 因为这些小的平移调节剂控制干细胞的命运和行为, 而不会受到稳定基因组整合的危害。因此, 该协议代表了 hdfsc 的一个安全和有效的工程过程, 这可能成为重要的优化其治疗效果。
人牙囊是一个松散的外皮衍生结缔组织周围的发展中的牙齿 1,2。除了协调骨分裂和成骨的功能, 牙齿爆发过程中, 该组织窝藏和祖细胞, 特别是为牙周组织 3,4,5的发展。因此, 牙囊被认为是收获人类成人干细胞6,7的替代来源。
几项研究表明, 人类牙囊干细胞 (hdfsc) 能够分化为牙周系, 包括成骨细胞、韧带成纤维细胞和骨板8,9,10.此外, 这些细胞被证明符合间充质间质间质细胞 (mscs) 的所有特征, 包括自我更新能力, 塑料粘附, 特定表面标记物的表达 (如 cd73, cd90, cd105), 以及成骨,脂原和软骨分化潜力11,12,13。其他研究还揭示了 hdfsc2、14、15、16、17、18的神经分化潜力。
由于其具有广阔的特性和易于访问, hdfsc 最近与组织工程19、20、21 相关.第一批研究集中于 dfsc 再生骨、牙周和牙根的潜力19、22、23、24、25、26、 27,28,29,30。自从了解 hdfsc 的神经源性能力以来, 对其作为神经退行性疾病潜在治疗方法的应用进行了 31、32、33项研究。hdfsc 在其他组织 (如角膜上皮) 的再生方面也变得越来越重要,34,35。hdfsc 的治疗潜力不仅取决于其直接分化潜力, 还取决于其副分泌活性。最近, hdfsc 已被证明分泌了大量的生物活性因子, 如基质金属蛋白酶 (mmp)、胰岛素样生长因子 (igf)、血管内皮生长因子 (vegf)、碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf) 和肝细胞生长因子 (hgf), 在血管生成、免疫调节、额外细胞基质重塑和修复过程中起着至关重要的作用36。
然而, 干细胞治疗的广泛临床翻译仍然受到几个挑战的损害, 如大规模初始细胞死亡和低有益干细胞效应37,38。基因工程为应对这些挑战提供了一个很有希望的策略, 因此可以大大提高干细胞的治疗效果 38、39、40.对于瞬态细胞操作, 微 rna (miRs) 是合适的候选, 因为这些小的平移调节剂控制干细胞的命运和行为, 而不会受到稳定基因组整合的危险 41,42,43. 迄今为止, 已确定了若干有益的 miRs, 以促进干细胞增殖、存活、归巢、辅助治疗活动以及它们被分化为几个血统44。例如, 与未经修饰的 mscs 45 相比, miR-133a 工程 mscs在梗死大鼠心脏中的存活率和植入物增加, 从而改善了心功能。同样, miR-146a 过度表达骨髓间充质干细胞被证明会分泌更多的 vegf, 这反过来又提高了缺血组织46的治疗效率。
本文详细介绍了 hdfsc 的选择性提取和基因工程。为此, 我们描述了人类毛囊的收获和酶消化, 以及随后 hdfsc 的分离。为了确定分离细胞的特征, 根据国际细胞治疗协会13的准则, 列入了核查海安会特性的重要说明。此外, 我们还应用阳离子脂质转染策略, 并对转染效率和细胞毒性进行评价, 对 mirr 改性 hdfsc 的产生进行了详细的描述。
成人干细胞目前是治疗几种退行性疾病的重点。特别是骨髓 (bm) 衍生干细胞, 包括造血干细胞 (hsc) 和骨髓间充质干细胞, 正在进行密集的临床调查47。然而, bm 收获是一种侵入性的程序, 在捐赠地点引起疼痛, 并可能导致不良事件48。最近, 产后牙齿组织已成为一种新的、易于获取的干细胞来源。这些牙科干细胞被证明符合 msc 的所有特性, 并显示出更高的增殖能力?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了罗斯托克大学医疗中心 forun 方案 (889018) 和 damp 基金会 (2016-11) 的支持。此外, pm. 和 r. d. 还由 bmbf (vip + 00240) 提供支持。
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
ZEN2011 software | Zeiss | ||
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |