절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

Summary

이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

Abstract

날짜 하려면, 서로 다른 발달 단계에서 여러 줄기 세포 유형 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 초점에 있습니다. 그러나, 초기 대규모 세포 죽음 및 낮은 치료 효과 등의 특정 양상 그들의 광범위 한 임상 번역 손상. 유전 공학 이식 전에 줄기 세포의 줄기 세포 치료 효과 최적화 하는 유망한 방법으로 등장. 그러나, 안전 하 고 효율적인 유전자 전달 시스템은 여전히 부족 합니다. 따라서, 적당 한 방법의 개발 줄기 세포 기반 요법에서 현재의 과제를 해결 하는 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

현재 프로토콜은 그들의 비 바이러스 성 유전자 조작 뿐만 아니라 추출 및 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs)의 특성을 설명합니다. 출생 후 치과 여 포는 높은 확산 잠재력을 보유 하는 성인 multipotent 줄기 세포를 수확 한 유망 하 고 쉽게 접근할 수 있는 소스로 발표 했다. 설명된 격리 절차 영향 을된 지혜의 이빨에서 hDFSCs 수확 간단 하 고 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 또한이 프로토콜 구성 고립 된 세포의 줄기 세포 특성을 정의 하는 방법. HDFSCs의 유전 공학에 대 한 최적화 된 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략 세포 독성 효과 유발 하지 않고 사용 하면 매우 효율적인 예측에 관한 소개를 제공 됩니다. 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합의 위험 없이 줄기 세포의 행동 MicroRNAs 과도 셀 조작에 대 한 적합 한 후보자는. 따라서,이 프로토콜 최적화 그들의 치료 효능에 대 한 중요 한 될 수 있습니다 hDFSCs의 엔지니어링에 대 한 안전 하 고 효율적인 절차를 나타냅니다.

Introduction

인간의 치과 여 포 개발 치아^1,2를 둘러싼 느슨한 ectomesenchymally 파생 결합 조직 이다. Osteoclastogenesis 및 골 치아 분화 과정에 대 한 조정 하는 기능 옆에 있는이 조직 특히 periodontium^3,,45의 개발에 대 한 줄기와 조상 세포를 항만. 따라서, 치과 여 포는 인간 성인 줄기 세포^6,7을 수확 하 대체 소스로 간주 됩니다.

여러 연구 결과 인간의 치과 여 포 줄기 세포 (hDFSCs) osteoblasts, 인 대 섬유 아 세포, cementoblasts^8,,910 을 포함 한 치 주 혈통으로 차별화 할 수 있다 설명 했다 . 또한, 이러한 세포 mesenchymal stromal 세포 (MSCs)의 자기 갱신 용량, 플라스틱 준수, 표현의 특정 표면 마커를 포함 하 여 모든 특성에 맞게 표시 했다 (예:, CD73, CD90, CD105)으로 osteogenic 뿐만 adipogenic 및 chondrogenic 분화 잠재적인^11,,1213. 다른 연구는 또한 hDFSCs^{2,,1415,16,,1718}의 신경 감 별 법 잠재력을 계시 했다.

그들의 유망한 속성 및 쉬운 접근, hDFSCs 최근 조직 공학^19,,2021관련 되었다. 첫 번째 연구는 치 주 뼈 생성에 DFSCs의 잠재력에 집중 하 고 치아 뿌리^{19,22,23,,2425,26, 27,,2829,30}. HDFSCs의 neurogenic 기능의 지식, 신경 퇴행 성 질환에 대 한 잠재적인 치료로 그들의 응용 프로그램은 이후 조사^31,,3233. HDFSCs 또한에 중요성을 얻고 있다 고 다른 조직 (예: 각 막 상피)^34,35의 재생. HDFSC의 치료 잠재력은 그들의 paracrine 활동에 뿐만 아니라 그들의 직접적인 감 별 법 잠재력에만 근거 하지 않는다. 최근, hDFSCs 보였다 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 인슐린과 같은 성장 인자 (IGF), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) hepatocyte 성장 등 생리 활성 요인의 분 비 인수 (HGF), 신생, immunomodulation, 개장 하는 엑스트라 세포 매트릭스 및 회복 과정³⁶에 대 한 중요 한 역할입니다.

그러나, 줄기 세포 치료의 광범위 한 임상 번역은 여전히 대규모 초기 세포 죽음 및 낮은 도움이 줄기 세포 효과^37,38등 여러 문제에 의해 손상 된다. 유전 공학 이러한 과제를 해결 하기 위해 유망 전략을 제공 하 고 따라서 매우 줄기 세포^38,,3940의 치료 효능을 강화할 수 있다. 변이 세포 조작, microRNAs (미르)는 적합 한 후보자, 이러한 작은 변환 레 귤 레이 터 제어 운명과 안정적인 게놈 통합^41,42, 의 위험 없이 줄기 세포의 행동으로 ⁴³. 날짜, 여러 가지 유익한 미르 확인 된 줄기 세포 증식, 생존, 유도, paracrine 활동 뿐만 아니라 여러 계보⁴⁴로 그들의 차별화 홍보. 예를 들어, 미르 133a 설계 MSCs 수정 되지 않은 MSCs⁴⁵에 비해 향상 된 심장 기능의 결과로 infarcted 쥐 마음에 증가 생존 및 engraftment를 보여주었다. 마찬가지로, 미르-146a overexpressing MSCs 분 비 허 혈 성 조직⁴⁶에서 향상 된 치료 효율 주도 차례에 VEGF의 더 높은 금액을 표시 했다.

이 원고는 선택적 추출 및 hDFSCs의 유전 공학에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 목적을 위해 우리 인간의 치과 여 포의 수확과 효소 소화 뿐만 아니라 hDFSCs의 후속 격리를 설명합니다. 고립 된 세포의 성격을 나타내기 위하여 MSC 속성의 확인에 대 한 중요 한 지침¹³세포 치료 대 한 국제 사회의 지침에 따라 포함 되었습니다. 또한, 우리는 양이온 지질에 기초를 둔 transfection 전략과 transfection 효율 및 세포 독성 평가 적용 하 여 미르 수정 hDFSCs의 생성에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다.

Protocol

HDFSCs 부의 구강 및 악 안 면 성형 수술으로 스톡 대학 의료 센터에서 제공 하는 추출 된 사랑니의 치과 여 포에서 격리 됩니다. 동 및 서 면된 승인 모든 환자에서 얻은 했다. 이 연구는로 스톡 대학 (권한 No. 2017-0158)의 로컬 윤리 위원회에 의해 허가 했다. 1입니다. hDFSCs의 격리 참고: 세균 오염을 방지 하기 위해, 사랑니 해야 하지 추출 하기 전에…

Representative Results

여기, 우리 인간의 치과 여 포 조직에서 hDFSCs을 수확 하는 상세한 격리 명령을 제시. 일상적인 수술 동안 치과 여 포의 쉬운 접근으로 성체 줄기 세포의 추출에 대 한 유망한 근원 이다. 격리 된 hDFSCs MSCs13의 정의 대 한 설명 하는 모든 특성을 보였다. 사실, 셀 플라스틱 부착 했다 아래 문화 상태를 설명 하 고 ?…

Discussion

성인 줄기 세포는 현재 여러 퇴행 성 질환의 치료에 대 한 집중에 있습니다. 특히, 뼈 골 수 (BM)-줄기 세포, 조 혈 줄기 세포 (HSCs)를 포함 하 여 파생 된 MSCs, 집중 임상 조사⁴⁷그리고. 그러나, BM 수확 기부 사이트에 통증을 일으키는 침략 절차 이며⁴⁸부작용 이어질 수 있습니다. 최근, 출생 후 치과 조직 줄기 세포에 대 한 소스를 쉽게 접근할 수 있는 고로 떠오르고 …

Materials

Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA1557A488	Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488	Bio-Rad	MCA928A488	monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody	BD Biosciences	559883	Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody	BD Biosciences	555751	Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody	BD Biosciences	550257	Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody	BD Biosciences	555749	Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody	BD Biosciences	339217	Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody	BD Biosciences	557872	Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody	BD Biosciences	560531	Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody	BD Biosciences	558304	Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody	BD Biosciences	561557	Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody	BD Biosciences	55095	Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody	BD Biosciences	560777	Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody	BD Biosciences	560787	Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575-020	0.5M, pH 8.0
Steritop	Merck Millipore	SCGPT05RE	0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
PFA	Merck Millipore	1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit	R&D Systems	SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1	Thermo Fisher Scientific	AM17120	5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1	Thermo Fisher Scientific	AM17110	5nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055	polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21202	polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope	Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2	BD Biosciences
ZEN2011 software	Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)	Biochrom	L2143	in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
PBS (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12	Thermo Fisher Scientific	11039021
Antibiotic, ZellShield	Biochrom	W 13-0050
FBS	Thermo Fisher Scientific	10500064
Collagenase type I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm	Braun	4099206
50 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62,547,254
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62,554,502
Cell culture flask 75 cm2	Sarstedt	833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2	Sarstedt	833,911,002
Freezing medium, Biofreeze	Biochrom	F 2270
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	377267	1.8 mL
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4 %
Counting chamber	Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%	Mibe
NaCl solution	Braun		0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide	Ethicon		3 – 0