Этот протокол описывает переходных генной инженерии Стоматологическая стволовых клеток, извлеченные из человеческих зубов фолликула. Прикладной-вирусных модификации стратегия может стать основой для улучшения продуктов терапевтического стволовых клеток.
На сегодняшний день, несколько типов стволовых клеток на разных этапах своего развития находятся в центре внимания для лечения дегенеративных заболеваний. Тем не менее некоторые аспекты, такие как первоначальный массивные клеточной смерти и низкий терапевтический эффект, нарушение их широкого клинического перевод. Генной инженерии стволовых клеток до трансплантации возникла как перспективный метод для оптимизации эффекты терапевтического стволовых клеток. Однако по-прежнему отсутствуют гена безопасных и эффективных систем доставки. Таким образом разработка подходящих методов могут обеспечить подход к решению текущих проблем в терапии на основе стволовых клеток.
Настоящий Протокол описывает добычи и характеристика человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток (hDFSCs) а также их не вирусная генетическая модификация. Послеродовой Стоматологическая фолликула обнародовал как источник перспективных и легко доступны для уборки Multipotent с экстрактами стволовых клеток обладающих высоким распространением потенциал. Процедуре описано изоляции представляет простой и надежный способ для сбора hDFSCs от Ретинированные зубы мудрости. Также этот протокол включает методы для определения характеристик стволовых клеток изолированных клеток. Для генной инженерии hDFSCs оптимизированный Катионный липидных трансфекции стратегия представлен стимулирующей внедрение высокоэффективных микроРНК не вызывая цитотоксических эффектов. МикроРНК, подходящих кандидатов для манипуляции переходных клеток, эти небольшие поступательные регуляторов управления судьбу и поведением стволовых клеток без опасности стабильной генома интеграции. Таким образом этот протокол является безопасной и эффективной процедуры для техники hDFSCs, которые могут оказаться важными для оптимизации их терапевтической эффективности.
Человеческих зубов фолликула это рыхлой соединительной ткани, ectomesenchymally производные, окружающих развивающихся зуба1,2. Помимо своей функции по координации osteoclastogenesis и Остеогенез для процесса извержения зуба эта ткань затаивает стволовых и прогениторных клеток, особенно для развития периодонт3,4,5. Таким образом Стоматологическая фолликула рассматривается как альтернативного источника для сбора стволовых клеток человека взрослых6,7.
Несколько исследований показали, что человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток (hDFSCs) способны дифференцироваться в линии пародонта, включая остеобластов, связки фибробластов и cementoblasts8,9,10 . Кроме того, эти клетки были показаны для соответствия всех характеристик мезенхимальных стромальных клеток (МСК) включая самостоятельного обновления потенциала, пластиковые присоединения, выражения конкретных поверхностных маркеров (например, CD73, CD90, CD105) также как остеогенные, адипогенном и хондрогенном дифференциация потенциальных11,12,13. Другие исследования также показали нейронных дифференциация потенциал hDFSCs2,14,,1516,17,18.
Благодаря их перспективных свойств и легкий доступ hDFSCs стала недавно соответствующие ткани инженерных19,,2021. Первые исследования сосредоточены на потенциал DFSCs для регенерации костей, пародонта и зуб корни,19,,2223,24,25,26 27,28,29,30. Знание нейрогенный возможности hDFSCs их применение в качестве потенциальных лечение нейродегенеративных заболеваний после исследованы31,,3233. HDFSCs также приобрели важное значение в связи с регенерации других тканей (например, эпителий роговицы)34,35. Терапевтический потенциал hDFSC основан не только на их потенциал прямых дифференциации, но и на их ответные действия. Недавно было показано hDFSCs выделяют множество биологически активных факторов, таких как матрицы металлопротеиназ (MMPs), инсулин подобный фактор роста (IGF), Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основные фибробластический фактор роста (bFGF) и роста гепатоцитов фактор (HGF), которые играют решающую роль по ангиогенез, иммуномодуляция, Ремоделирование дополнительных клеточных матриц и репаративные процессы36.
Однако широкого клинического перевод стволовых клеток до сих пор препятствует ряд проблем, таких, как массовые первоначальная клеточная смерть и низкой выгодно стволовых клеток эффекты37,38. Генной инженерии обеспечивает перспективные стратегии для решения этих проблем и поэтому могут значительно повысить терапевтическую эффективность стволовых клеток38,,3940. Для манипуляции переходных клеток микроРНК (Мирс) являются подходящими кандидатами, как эти небольшие поступательные регуляторов управления судьбу и поведением стволовых клеток без опасности стабильным геномом интеграции41,42, 43. до настоящего времени, были определены несколько полезных Мирс, поощрение распространения стволовых клеток, выживание, головка самонаведения, паракринными деятельность, а также их дифференцировку в несколько линий44. К примеру мир 133а инженерии MSCs, показало увеличение выживаемости и приживления в сердцах infarcted крысы, что приводит к улучшению функции сердца, по сравнению с неизмененной MSCs45. Кроме того мир 146А избытком MSCs были продемонстрированы секретировать VEGF, который в свою очередь привело к расширенной терапевтическую эффективность при ишемии ткани46большее количество.
Эта рукопись представляет подробный протокол для селективного извлечения и генной инженерии hDFSCs. Для этой цели мы описали, сбора урожая и ферментативные пищеварения человека Стоматологическая фолликулов, а также последующие изоляции hDFSCs. Для того чтобы характеризовать изолированных клеток, были включены в соответствии с руководящими принципами международного общества для клеточной терапии13важные инструкции для проверки свойств MSC. Кроме того мы предоставляем подробное описание для поколения мир модифицированных hDFSCs, применяя стратегию Катионный липидных transfection и оценки эффективности transfection и цитотоксичность.
Взрослые стволовые клетки в настоящее время в фокусе для лечения ряда дегенеративных заболеваний. В частности, костного мозга (BM)-стволовые клетки, включая гемопоэтических стволовых клеток (СКК) и MSCs, находятся под интенсивным клиническое исследование47. Однако BM уборки инв…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана программа FORUN медицинский центр университета Ростока (889018) и Фондом влажной (2016-11). Кроме того, часов и р.д. поддерживаются BMBF (VIP + 00240).
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
ZEN2011 software | Zeiss | ||
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |