Det här protokollet beskriver övergående gentekniken dental stamceller utvinns ur mänskliga dentala follikeln. Tillämpad icke-virala modifiering strategin kan bli underlag för förbättring av terapeutiska stamceller produkter.
Hittills har är flera stamceller typer i olika utvecklingsstadier i fokus för behandling av degenerativa sjukdomar. Ändå nedsatt vissa aspekter, såsom inledande massiva celldöd och låga terapeutiska effekter, deras breda kliniska översättning. Genteknik av stamceller före transplantation uppstod som en lovande metod för att optimera terapeutiska stamceller effekter. Säker och effektiv gen leveranssystem saknas dock fortfarande. Utvecklingen av lämpliga metoder kan därför ge en strategi för att lösa aktuella utmaningar i stamceller-baserade behandlingar.
Protokolls beskriver extraktion och karakterisering av mänskliga dentala follikeln stamceller (hDFSCs) samt deras icke-virala genetisk modifiering. Postnatal dentala follikeln Avtäcka som en lovande och lättillgänglig källa för skörd multipotenta stamceller från vuxna som har hög spridning potential. Förfarandet beskrivs isolering presenterar en enkel och tillförlitlig metod för att skörda hDFSCs från påverkade visdomständer. Detta protokoll omfattar också metoder för att definiera stamcellsforskning egenskaperna hos isolerade celler. För genteknik av hDFSCs presenteras en optimerad katjoniska lipid-baserade transfection strategi möjliggör högeffektiv mikroRNA introduktion utan att orsaka cytotoxiska effekter. MikroRNA är lämpliga kandidater för övergående cell manipulation, som dessa små translationell regulatorer styr ödet och beteende av stamceller utan risk för stabil genomet integration. Detta protokoll utgör därmed, ett säkert och effektivt förfarande för konstruktion av hDFSCs som kan bli viktiga för att optimera deras terapeutiska effekt.
Mänskliga dentala follikeln är en lös ectomesenchymally-derived bindväv som omger den framkallande tand1,2. Bredvid sin funktion att samordna osteoclastogenesis och osteogenesis för tand utbrott processen, hamnar denna vävnad stamceller och stamceller celler särskilt för utvecklingen av den periodontium3,4,5. Därför, dentala follikeln är ansedd som en alternativ källa till skörd mänskliga stamceller6,7.
Flera studier visat att mänskliga dentala follikeln stamceller (hDFSCs) klarar av att skilja i den parodontala härstamning inklusive osteoblaster, ligament fibroblaster och cementoblasts8,9,10 . Dessutom dessa celler visades att matcha alla kännetecken av mesenkymala stromaceller (MSCs) inklusive själv förnya kapacitet, plast följsamhet, uttryck för specifika yta markörer (t.ex., CD73, CD90, CD105) samt som osteogent, adipogena och chondrogenic differentiering potentiella11,12,13. Andra studier visade också en neurala differentiering potential av hDFSCs2,14,15,16,17,18.
På grund av deras lovande egenskaper och enkel tillgång blev hDFSCs nyligen relevant för tissue engineering19,20,21. De första studierna koncentreras till DFSCs potential att regenerera ben, parodontala och tand rötter19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Deras tillämpning som potentiell behandling för neurodegenerativa sjukdomar har sedan kunskapen av neurogen förmåga hDFSCs, undersökta31,32,33. HDFSCs har också blivit allt viktigare med den förnyelse av andra vävnader (t.ex. hornhinneepitelet)34,35. Den terapeutiska potentialen i hDFSC bygger inte endast på deras direkta differentiering potential men också på deras parakrin aktivitet. Nyligen, hDFSCs har visat att utsöndra en mängd bioaktiva faktorer, såsom matrix metalloproteinaser (MMP), insulin-liknande tillväxtfaktor (IGF), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), basic fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) och hepatocyte tillväxt faktor (HGF), som spelar en avgörande roll för angiogenes, immunmodulering, extracellulära matrix remodeling och reparativa processer36.
Breda kliniska översättning av stamcellsterapi är dock fortfarande nedsatt av flera utmaningar, såsom massiva första celldöd och låg fördelaktigt stamceller effekter37,38. Genteknik ger en lovande strategi för att möta dessa utmaningar och därför kan kraftigt öka den terapeutiska effekten av stamceller38,39,40. För övergående cell manipulation är mikroRNA (miRs) lämpliga kandidater, som dessa små translationell regulatorer styr ödet och beteende av stamceller utan risk för stabil genomet integration41,42, 43. hittills har flera välgörande miRs har identifierats att främja stem cell spridning, överlevnad, dråpare, parakrin aktivitet samt deras differentiering till flera härstamningar44. Till exempel, konstruerad miR-133a MSCs visade en ökad överlevnad och engraftment i infarcted rat hjärtan vilket resulterar i en förbättrad hjärtfunktion jämfört med oförändrad MSCs45. Likaså visades miR-146a överuttryck MSCs att utsöndra större mängder VEGF som i sin tur ledde till en förbättrad terapeutisk effektivitet i ischemisk vävnad46.
Detta manuskript presenterar en detaljerad protokollet för selektiv extraktion och genteknik av hDFSCs. För detta ändamål beskrev vi skörd och enzymatisk nedbrytning av mänskliga dental folliklar samt efterföljande isoleringen av hDFSCs. För att karakterisera isolerade celler, har viktiga anvisningar för verifiering av MSC boenden inkluderats i enlighet med riktlinjerna från International Society for cellterapi13. Dessutom ger vi en detaljerad beskrivning för generering av miR-modifierat hDFSCs genom att tillämpa en strategi för katjoniska lipid-baserade transfection och utvärderingen av transfection effektivitet och cytotoxicitet.
Adulta stamceller är för närvarande i fokus för behandling av flera degenerativa sjukdomar. I synnerhet ben märg (BM)-härrör stamcellerna, inklusive hematopoetiska stamceller (Förenta) och MSCs är under intensiv klinisk undersökning47. BM skörd är dock en invasiv förfarande som orsakar smärta på platsen för donation och kan leda till biverkningar48. Nyligen, postnatal dentala vävnaden har vuxit fram som en ny och lättillgänglig källa för stamceller. Des…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av programmet FORUN Rostock universitet medicinska centrum (889018) och fuktig stiftelsen (2016-11). I tillägg, P.M. och R.D. stöds av BMBF (VIP + 00240).
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
ZEN2011 software | Zeiss | ||
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |