Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Summary

Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.

Abstract

Mitophagy is een proces van selectief verwijderen van beschadigde of onnodige mitochondriën met behulp van autophagy machines. Nauwe banden tussen defect mitophagy en verschillende ziekten bij de mens, met inbegrip van neurodegeneratieve ziekten, kanker en metabole ziekten gevonden. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat mitophagy is betrokken bij normale cellulaire processen, zoals differentiatie en ontwikkeling. Echter, de precieze rol van en de moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de mitophagy nader moeten worden onderzocht. Daarom is het van cruciaal belang voor het ontwikkelen van een krachtige en handige methode voor het meten van veranderingen in de mitophagy activiteit. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor kwantitatief beoordeling mitophagy activiteit via cytometry van de stroom met behulp van de mitochondriën-gerichte fluorescent proteïne Keima (mt-Keima). Deze stroom cytometry assay kunt analyseren mitophagy activiteit sneller en gevoeliger dan conventionele microscopie of immunoblotting gebaseerde methoden. Dit protocol kan worden toegepast om te analyseren mitophagy activiteit in verschillende celtypen.

Introduction

Mitochondriën zijn organellen die essentieel voor de celproliferatie en fysiologie zijn. Mitochondriën zijn verantwoordelijk voor het genereren van meer dan 80% van de ATP-levering via oxidatieve fosforylatie, en ze bieden ook verschillende metabole tussenproducten voor biosynthese en metabolisme^1,2. Naast hun rollen in energievoorziening en metabolisme spelen mitochondriën centrale rol in vele andere belangrijke processen, met inbegrip van reactieve zuurstof soorten (ROS) generatie, de regulering van celdood en intracellulaire Ca^{2 +} dynamiek³ . Wijzigingen in de mitochondriale functie zijn geassocieerd met menselijke ziekten, waaronder kanker, diabetes mellitus en diverse neurodegeneratieve ziekten-^4,5. Verhoogde mitochondriale dysfunctie en mitochondriële DNA-mutaties zijn ook gedacht bij te dragen tot de normale veroudering processen^6,7,8. Kwaliteitscontrole is daarom een cruciaal punt in de mitochondriën. Mitochondriën zijn hoogdynamische organellen die continu hun vorm tussen langwerpige netwerken en korte, gefragmenteerde vorm kunnen wijzigen. Mitochondriën dynamiek speelt een belangrijke rol bij het handhaven van de functie van mitochondriën, alsmede hun afbraak tot en met mitophagy⁹.

Mitophagy is een mechanisme waarbij de selectieve afbraak van hele mitochondriën met behulp van de autophagy machines. Mitophagy is het principe mechanisme onderliggende mitochondriale omzet en het verwijderen van beschadigde of disfunctionele mitochondriën. In dit proces, zijn eerste mitochondriën omgeven door een membraan, wat resulteert in de vorming van autophagosomes, die vervolgens met lysosomen voor aantasting van de Hydrolytische^{9 smelten}. Vorige genetische studies in Drosophila hebben gesuggereerd dat twee genen van Parkinson-gerelateerde, PTEN-geïnduceerde putatief kinase 1 (PINK1) (PARK6) en Parkin (PARK2), functioneren in de zelfde traject^10,11. Deelrij studies hebben aangetoond dat het PINK1-Parkin-traject verantwoordelijk is voor het elimineren van beschadigde mitochondriën en in dit traject resultaat in disfunctionele mitophagy gebreken en tot ziekten bij de mens^{12,13 bijdragen kan}. Defecten in mitophagy processen hebben onlangs gevonden in verschillende menselijke ziekten, waaronder kanker, hart-en vaatziekten, leverziekten en neurodegeneratieve ziekte ¹⁴. Bovendien, hebben recente studies ook aangetoond dat mitophagy is essentieel voor veel fysiologische processen, zoals de immuunrespons^{15,16,17,18, differentiatie en ontwikkeling ,19}, suggereren dat mitophagy kan een actievere rol bij het beheersen van de functies van de cel.

Ondanks de recente bevestiging dat mitophagy een belangrijke rol in zowel kwaliteitscontrole in mitochondriën speelt en ziekten bij de mens, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de mitophagy blijven slecht begrepen. Hoewel mitophagy-gerelateerde mechanismen zijn systematisch bestudeerd in gist, hebben studies gericht op het verkennen van mitophagy-gerelateerde mechanismen in zoogdiercellen voornamelijk gericht op de PINK1-Parkin-pathway. Eerdere studies hebben vastgesteld dat de PINK1-Parkin-traject primair verantwoordelijk voor het selectief verwijderen van beschadigde mitochondria via mitophagy^{12,20,21 is}. Recente studies hebben echter gemeld dat in sommige modellen, mitophagy zelfs in de afwezigheid van functionele PINK1^22,–^23,24kan worden geactiveerd. Deze resultaten suggereren dat naast de PINK1-Parkin-traject, daar een extra niet-geïdentificeerde traject die mitophagy kunt activeren.

Het ontbreken van een handige methode om te beoordelen van de mitophagy activiteit is een groot obstakel voor het verkennen van de trajecten die mitophagy en haar rol in de pathofysiologische gebeurtenissen regelen. Elektronenmicroscopie is een krachtig hulpmiddel om te visualiseren direct autophagosome-overspoeld mitochondriën. Elektronenmicroscopie heeft echter beperkingen in het kwantificeren van de mitophagy activiteit. Hoewel strategieën die microtubulus-geassocieerde proteïne-1 gebruiken ketting 3 (LC3 licht)-geconjugeerd fluorescerende sondes, zoals GFP-LC3, zijn momenteel de meest gebruikte benaderingen²⁵, de voorbijgaande aard van het signaal LC3 gebaseerde en de hoge mate van vals-positieve signalen beperken de gevoeligheid voor het opsporen van mitophagy in cellen²⁶. Een combinatie van het westelijke bevlekken voor het meten van eiwitten mitochondriaal niveau, de kwantificering van mitochondriaal DNA en fluorescentie microscopie analyse colocalize mitochondriën met autophagosomes of lysosomen zou een goed uitgangspunt voor de beoordeling van mitophagy. Maar aanroepen kwantificering beperkingen en een gebrek aan gemak van bestaande methoden voor nieuwe benaderingen. De invoering van een nieuwe pH-afhankelijke TL proteïne, de mitochondriale doel Keima (mt-Keima), verbeterd sterk de mogelijkheid om te detecteren mitophagy²⁷. Door het smelten van de mitochondriale-targeting opeenvolging van cytochroom c oxidase subeenheid VIII (COX VIII) in Keima, is mt-Keima gericht op de mitochondriale matrix. De grote verschuiving in de excitatie piek van Keima van 440 nm tot 586 nm (overeenkomend met pH 7 en pH 4, respectievelijk) kan worden gebruikt om te beoordelen mitophagy met goede gevoelig in zowel in vitro als in vivo experimenten^28,29 . De weerstand van mt-Keima aan de aantasting van de lysosomale veroorzaakt en wat nog belangrijker is, de integratie van het mt-Keima signaal in lysosomen, waardoor het gemakkelijk kwantitatieve meting van mitophagy activiteit. De fluorescentie wijzigen dat in mt-Keima optreedt kan worden geanalyseerd met behulp van beide confocale microscopie of stroom cytometry^28,29. Een stroom cytometry gebaseerde methode voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van mt-Keima heeft echter niet in detail tot nu toe gekregen.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een stroom cytometry gebaseerde techniek voor het meten van mitophagy activiteit in cellen met behulp van mt-Keima. Hoewel we hebben hier aangetoond dat stroom cytometry analyse met succes CCCP-geïnduceerde mitophagy gedetecteerd in HeLa cellen uiten Parkin, kan deze techniek worden toegepast op een breed scala aan celtypes.

Protocol

1. generatie van HeLa cellen uiten mito-Keima (mt-Keima) Voorbereiding van mt-Keima lentivirus Jas van een schotel van 100 mm cultuur door toevoeging van 2 mL 0,001% poly-L-lysine /-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en laat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur staan. Verwijder de poly-L-lysine oplossing om met een glazen pipet verbonden met een vacuüm en wassen van de cultuur-schotel door toevoeging van 2 mL 1 x PBS. Plaat 1.5 x 106 HEK293T c…

Representative Results

Een voorbeeld van de stroom cytometry analyse van CCCP-geïnduceerde mitophagy in HeLa-Parkin cellen is weergegeven in Figuur 4. Met behulp van de stroom cytometry analyse hierboven beschreven methode, kunnen we een dramatische toename in mitophagic cellen in de “hoge” poort detecteren. Het percentage cellen in de “hoge” poort steeg meer dan 10-fold in vergelijking met onbehandelde cellen (figuur 4A). Deze toename van de activite…

Discussion

Hier presenteren we een snelle en gevoelige methode voor het gebruik van stroom cytometry voor het meten van cellulaire mitophagy activiteit in cellen uiten van mt-Keima. Cellen ondergaan van een hoog niveau van mitophagy vertonen een hogere ratio van PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitatie. Dus kan mitophagy activiteit worden uitgedrukt als het percentage cellen een hoge verhouding van de 561/405 tentoonstellen. We het percentage van de cellen in het gebied van de “hoge” poort op een perceel van de dot van PE-CF594…

Materials

REAGENTS
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
penicillin/streptomycin	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermos scientific	R0531
0.45 μm syringe filter	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromycin	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
trypsin-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)