الكشف عن الفيروسات من بيوايروسولس استخدام الراتنجات التبادل شاردة
Summary
تبادل شاردة الأسلوب القائم على راتنج، تتكيف مع سائل يدل بيوايروسول المستندة إلى اصطدام لأخذ العينات من الفيروسات. عندما يقترن مع الكشف الجزيئي المصب، الأسلوب يسمح للكشف عن الفيروسات من بيوايروسولس سهلة وحساسة.
Abstract
هذا البروتوكول يوضح أسلوب أخذ عينات بيوايروسول مخصصة للبحث عن الفيروسات. في هذا النظام، مقرونة بأجهزة جمع العينات السائلة الهواء المستندة إلى اصطدام لتركيز فعال من الفيروسات مشحونة سلبا على راتنج تبادل شاردة من بيوايروسولس. وهكذا، الراتنج بمثابة خطوة إضافية تركز في سير العمل بيوايروسول أخذ العينات. ثم يتم استخراج الحمض النووي من الجسيمات الفيروسية مباشرة من راتنج تبادل شاردة، مع مناسبة للتحليلات الجزيئية العينة الناتجة عن ذلك. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول غرفة بيوايروسول المواصفات قادرة على توليد بيوايروسولس محملة بالفيروس ضمن مجموعة متنوعة من الظروف البيئية، والسماح للرصد المستمر للمتغيرات البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة، سرعة الرياح، وتركيز الهباء الجوي الشامل. والميزة الرئيسية لاستخدام هذا البروتوكول هو زيادة الحساسية للكشف عن الفيروس، حسب تقييمها عن طريق مقارنة مباشرة إلى مرطام سائلة تقليدية غير معدلة. وتشمل المزايا الأخرى القدرة على التركيز الفيروسات مشحونة سلبا المتنوعة، منخفضة التكلفة من راتنج تبادل شاردة (~$0.14 كل عينة)، وسهولة الاستخدام. عجز هذا البروتوكول لتقييم العدوى جسيمات الفيروسية تمتز الراتنج من عيوبها، ويحتمل أن تكون الحاجة إلى الاستفادة المثلى من المخزن المؤقت العينات السائلة المستخدمة داخل مرطام.
Introduction
والغرض من هذا الأسلوب توفير منبر أخذ عينات بيوايروسول حساسة للغاية لتسهيل الكشف الجزيئي للفيروسات مشحونة سلبا من بيوايروسولس. الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك الجسيمات الفيروسية، يمكن أن يعيش في بيوايروسولس لفترات طويلة من الزمن1. بيوايروسولس يمكن السفر عبر مسافات طويلة نسبيا والحفاظ على الاستمرارية والعدوى، كما يدل على ذلك تفشي المرض المهلك التي نشأت من أبراج تقع على بعد 6 كم من الأفراد المتضررين التبريد الصناعي و أسفرت عن وفاة 182. يمكن أن يحدث في إعدادات متعددة الإرسال غير المباشر للفيروسات إلى البشر بوساطة من بيوايروسولس ولقد أظهر تفشي نوروفيروس في المدارس والمطاعم3،4. وبالمثل، يمكن أن يحدث انتقال بيوايروسول من الفيروسات في إعدادات الزراعية كما هو الحال في مزارع الدواجن والخنازير، مع هذا الطريق انتقال حيث تعتبر عاملاً رئيسيا في انتقال الفيروسات بين مرافق الإنتاج5، 6 , 7 , 8 , 9.
فعالة لأخذ العينات من بيوايروسولس محملة بالفيروس يسمح للتحسين في التشخيص السريع والتأهب لمنع اندلاع، كما هو مبين في المظاهرات في أي إتش 5 أسواق الإنفلونزا تم الكشف عن فيروسات من بيوايروسولس في الحيوانات الحية في الصين الولايات المتحدة10،11. تقنيات أخذ العينات بيوايروسول الحالية تنطوي على عدد من المبادئ التقاط الجسيمات مختلفة، ويمكن تصنيف على نطاق واسع في إيمبينجيرس، والأعاصير، والرواطم، والمرشحات12. وخارج نطاق هذا البروتوكول استفاضة وتغطي جميع مزايا وعيوب هذه المنابر لأخذ عينات فيروسات من بيوايروسولس؛ ومع ذلك، يمكن القول بأن غالبية هذه الأجهزة أخذ العينات لا يكون قد تم تحسين المجموعة من الفيروسات و bacteriophages13. وعلاوة على ذلك، العدوى الفيروسية الجسيمات تتأثر سلبيا غالباً، مع السائل إيمبينجيرس نظرت إلى الحفاظ على العدوى الفيروسية أكثر فعالية من أخذ عينات من الأجهزة مثل الرواطم أو مرشحات الصلبة14. ومع ذلك، عيب واحد من اصطدام السائل هو تأثير تمييع الهدف، الذي يحدث بسبب فيروسات يتم جمعها بكميات كبيرة نسبيا (عادة مل إيه تو زيرو) من السائل في وعاء جمع. عيب هام آخر ينطوي على كفاءة دون المستوى الأمثل من إيمبينجيرس السائلة تركيز جسيمات < 0.5 ميكرومتر في الحجم15. ومع ذلك، يمكن تحسين القبض على كفاءة هذه الأجهزة قبل التثبيت في مصفوفات الصلبة، التثبيت يمكن أن يعزز الحفاظ على الأحماض النووية الفيروسية والعدوى الفيروسية16،17.
وقد أثبتنا سابقا أن راتنج تبادل شاردة أداة فعالة لالتقاط وتركيز للفيروسات من مصفوفات السائل، بما في ذلك bacteriophages والجيش الملكي النيبالي وفيروس التهاب الكبد الوبائي أ، إتش البشري وفيروس الروتا18،19 ،20. كما حددتها الشركة المصنعة، راتنج تبادل شاردة المستخدمة في هذا العمل راتنج تبادل البوليستيرين شاردة قاعدة قوية ماكروريتيكولار فيها أمين رباعي فونكتيوناليزيد المجموعات جاذبية التوسط والقبض على الأنيونات في متوسط سائل21 . ونتيجة لذلك، يتوقع راتنج تبادل شاردة التقاط الفيروسات مع رسوم السطحية الصافية سلبية، بما في ذلك العديد من الفيروسات المعوية، وفيروسات الإنفلونزا وفيروسات أخرى ذات صلة بالصحة العامة والحيوانية.
البروتوكول الحالي ينطوي على إضافة راتنج تبادل شاردة إلى مرطام سائلة. في هذا النظام، الراتنج بمثابة خطوة تركز ثانوي للجسيمات الفيروسية في السائل مرطام. يمكن ثم التيد الأحماض النووية مباشرة بكميات صغيرة، توفير عينة مركزة للتحليلات الجزيئية. وهكذا، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو التحسن الذي طرأ على حساسية الكشف عن الفيروس، أساسا من خلال تخفيض حجم العينة. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاستيلاء غير محدد الأصيل المشحون سلبا على فيروسات، الأسلوب المرجح المطبقة للكشف عن عدد كبير من الفيروسات للفائدة. ويتجلى الأسلوب هنا، لسلالات لقاح من نوع A وفيروسات الإنفلونزا نوع B و coliphage فرنا MS2 (MS2). بعد اكتشاف هذه الفيروسات باستخدام فحوصات بكر qRT القياسية كما هو موضح سابقا22. لا ينبغي أن تتوقع المستخدم نقطة النهاية تواجه صعوبات في أداء هذا الأسلوب، لأن إدخال تعديلات على القائمة حاليا لا تشكل معدات اختلالات كبيرة في تدفق التقليدية بيوايروسول أخذ العينات والتحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويحدد هذا البروتوكول طريقة لالتقاط الفيروسية حساسة من بيوايروسولس باستخدام إيمبينجيرس السائلة المعدلة. هو الأسلوب الأمثل للكشف والتحديد الكمي للحمل الفيروسي في بيوايروسولس. تعديل محددة أثبتت هنا ينطوي على إضافة راتنج تبادل شاردة للسائل الواردة ضمن مرطام سائلة مشتركة. تم تطوير هذا الأس?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل بتمويل من مركز السيطرة على الأمراض/هي مركز Intermountain سهول عالية للصحة الزراعية والسلامة (5U54OH008085) وبرنامج كولورادو اكتشاف منح تقييم العلوم البيولوجية (14BGF-16).
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers–how far can contaminated aerosols spread?. The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -. P., Chen, Y. -. P., Gong, J. -. Y., Chen, Y. -. C., Cheng, C. -. C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
