Analysere størrelse, form og retningen av nettverk av kombinert astrocyttene

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere organiseringen av astrocytic nettverk. Metoden beskrevet minimerer bias å gi beskrivende tiltak av disse nettverkene som celletall, størrelse, område og posisjon i en kjerne. Anisotropy vurderes med en vectorial analyse.

Abstract

Det har blitt stadig klarere at astrocyttene modulerer neuronal funksjonen ikke bare i synaptic og encellede nivåer, men også for nettverket plan flate. Astrocyttene er sterkt knyttet til hverandre gjennom gapet veikryss og koplingen gjennom disse veikryss er dynamisk og sterkt regulert. En nye konseptet er at astrocytic funksjoner er spesialisert og tilpasset til funksjoner av neuronal krets som de er tilknyttet. Derfor er metoder å måle ulike parametere av astrocytic nettverk nødvendig for å bedre beskrive reglene styrer kommunikasjonen og kopling og til videre forstå deres funksjoner.

Her, ved hjelp av image analyseprogramvare (f.eks., ImageJFIJI), vi beskriver en metode for å analysere AC confocal bilder av astrocytic nettverk avslørt av fargestoff-kobling. Disse metodene tillater 1) en automatisert og upartiske deteksjon av merket celler, 2) beregning av størrelsen på nettverket, 3) beregning av fortrinnsrett retningen fargestoff spredt i nettverket, og 4) omplassering av nettverk i området av interesse .

Denne analysen kan brukes til å karakterisere astrocytic nettverk av et bestemt område, sammenligne nettverk av ulike områder knyttet til funksjoner eller sammenligne nettverk innhentet under ulike forhold som har ulike effekter på koblingen. Disse observasjonene kan føre til viktige funksjonelle hensyn. For eksempel analyserer vi astrocytic nettverk av en trigeminal kjernen, der vi tidligere har vist at astrocytic kobling er avgjørende for muligheten av neurons å bytte sine avfyring mønstre fra tonic til rytmisk sprengning¹. Ved å måle størrelsen, confinement og fortrinnsrett orientering av astrocytic nettverk i dette, kan vi bygge hypoteser om funksjonelle domener som de circumscribe. Flere studier tyder på at flere andre hjernen områder, inkludert fat cortex, lateral overlegen oliven, olfactory glomeruli og sensoriske kjerner i thalamus og hjernebarken å nevne noen, kan ha nytte av en tilsvarende analyse.

Introduction

Mange studier har beskrevet hvordan Nevron-astrocytter dialog på en sub mobilnettet eller synaptic kan ha implikasjoner i neuronal funksjoner og synaptic overføring. Det er godt etablert at astrocyttene er følsomme for rundt neuronal aktivitet. de har faktisk reseptorer for mange nevrotransmittere inkludert glutamat, GABA, acetylcholine og ATP (se tidligere utgitt av^2,3,4). Til gjengjeld behandler astrocytic ensheath synaptic elementer og innflytelse neuronal aktivitet både det og på extrasynaptic steder ved regulere ekstracellulære ioniske homeostase og slippe flere faktorer eller sendere som glutamat, D-serine og ATP ^{5 , 6 , 7}.

Ideen om at astrocyttene kan også modulerer neuronal funksjonen for nettverket plan flate har dukket opp, med bevis at astrocytic reguleres romlig og tilsvarer neuronal segmentering i områder som er preget av en klar anatomiske compartmentalization (som områder med sensoriske representasjoner), indikerer at astrocyttene vil par til andre astrocyttene tjene samme funksjon i stedet for bare de som finnes i nærheten. I laterale overlegen olivenolje, for eksempel er mest astrocytic nettverk orientert ortogonalt til tonotopic akse⁸, mens i fat cortex eller olfactoty glomeruli, kommunikasjon mellom astrocyttene er mye sterkere i FAT eller glomeruli og svakere mellom tilstøtende de^9,10. I begge tilfeller er astrocytic nettverkene orientert mot midten av glomerule eller FAT^9,10.

Vi nylig viste at astrocytic aktivitet modulerer neuronal avfyring ved å redusere konsentrasjonen av ekstracellulære Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_e), antagelig gjennom utgivelsen av S100β, en Ca^{2 +}-bindende protein¹¹. Denne effekten, som ble demonstrert i en befolkning på trigeminal rhythmogenic nerveceller i dorsal del av trigeminal sensoriske kjernen (NVsnpr, å spille en viktig rolle i generasjon masticatory bevegelser), skyldes faktum at rytmisk avfyring i disse neurons er avhengig av en vedvarende Na⁺ gjeldende som er fremmet av nedgang [Ca^{2 +}]_e^11,12. Rytmisk avfyring i disse neurons kan “fysiologisk” brakt frem av stimulering av deres innganger eller kunstig nedgang av [Ca^{2 +}]_e. Vi viste videre at astrocytic koblingen var nødvendig for neuronal rytmisk avfyring¹. Dette hevet muligheten for at astrocytic nettverk kan danne omskrevet funksjonelle domener der neuronal aktivitet kan synkroniseres og koordinert. For å vurdere denne hypotesen, nødvendig vi første å utvikle en metode for å grundig dokumentere organiseringen av disse nettverk innen NVsnpr.

Tidligere studier på astrocytic nettverk har hovedsakelig beskrevet omfanget av koblingen i celle nummer og tetthet og området. Forsøk å evaluere form av astrocytic nettverk og retning av fargestoff-kopling ble hovedsakelig utført ved å sammenligne størrelsen på nettverk langs to akser (x og y) i fat cortex⁹, hippocampus^{13,14, 15}, barreloid felt av thalamus¹⁶, lateral overlegen oliven⁸, olfactory glomeruli¹⁰og cortex¹⁴. Metodene som er beskrevet her kan upartiske antall merkede celler i et nettverk og en vurdering av området de dekker. Vi har også utviklet verktøy til å definere foretrukket retningen på koblingen innenfor et nettverk og vurdere om foretrukne retningen er mot midten av kjernen eller i en annen retning. I forhold til tidligere brukte metoder gir denne protokollen et middel til å beskrive organisasjon og orientering av astrocytic nettverk i strukturer som dorsal trigeminal viktigste sensoriske kjernen som ikke har en kjent klart anatomiske compartmentalization. I ovenfor studiene, nettverk retningen er beskrevet som et forhold til formen på strukturen i seg selv som er allerede dokumentert (f.eks., barreloid i thalamus, fat i cortex, lag i hippocampus og cortex, glomeruli i den Luktelappen, etc.). I tillegg gir vectorial analyse sammenligninger av orientering avslørte under ulike forhold. Hvis du vil analysere om disse parametrene endres i henhold til plasseringen av nettverk i kjernen, utviklet vi også en metode for å erstatte hvert nettverk referanse til grensene for kjernen. Disse verktøyene kan enkelt tilpasses til andre områder for undersøke nettverk kombinert celler.

Protocol

Alle prosedyrer av kanadiske institutter for helseforskning reglene og ble godkjent av universitetet i Montreal dyr omsorg og bruk komiteen. 1. forberedelse av rotte hjernen skiver Forbered 1 L en sukrose-basert løsning (tabell 1) og 1 L standard kunstig cerebrale-spinalvæske (aCSF) (tabell 2). Boble sukrose-basert løsning med en blanding av 95% O2 og 5% CO2 (carbogen) i 30 min før du plasserer dem i-80 ° C i ca 3…

Representative Results

Kopling mellom cellene i hjernen er ikke statisk, men heller dynamisk regulert av mange faktorer. Metodene beskrevet ble utviklet til å analysere astrocytic nettverk avslørte under ulike forhold og å forstå deres organisasjon i NVsnpr. Disse resultatene er allerede publisert1. Vi utførte biocytin fylling av enkelt astrocyttene i dorsal del av NVsnpr i tre ulike forhold: på resten (i kontroll forhold i fravær av noen stimulering), i Ca2 +-gratis fo…

Discussion

Det finnes mange elektrofysiologiske metoder for å vurdere funksjonell kobling mellom astrocyttene^23,24. Disse metodene gir imidlertid ikke informasjon om anatomiske ordningen med astrocytic nettverk. En rekke studier har allerede vist at “fargestoff – eller tracer-kopling”, som her, oppstår bare i en brøkdel av kombinert celler som oppdages av elektrofysiologiske metoder^25,26,<sup class="xr…

Materials

NaCl	Fisher Chemicals	S671-3
KCl	Fisher Chemicals	P217-500
KH2PO4	Fisher Chemicals	P285-500
MgSO4	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500
C6H12O6 Dextrose anhydrous	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl2 dihydrated	Sigma	C70-500
Sucrose	Sigma	S9378
D-gluconic acid potassium salt	Sigma	G45001
MgCl2 anhydrous	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris Salt	Sigma	A9062
GTPTris Salt	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Carbenoxolone disodium salt	Sigma	C4790
avidin-biotin complex : ABC kit	Vestor laboratories	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Molecular Probes	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Xylene	Fisher Chemicals	X5-1
Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Slide Drying Bench	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544A
Microscope slide ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope	Olympus
40X water-immersion lens	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X water-immersion lens	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X water-immersion lens	Olympus	XLFLUOR4X/340
Micropipette puller	Sutter Instrument	P97
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP 225
Camera CCD	Sony	CX-ST50
Black and white monitor	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular devices	1322A
Patch Clamp amplifier	Axon instrument	Mulitclamp 700A
Electrophysiology acquisition software	Molecular devices	pClamp 8
Electrophysiology analysis software	Molecular devices	Clampfit 8
Imaging analysis software	ImageJFIJI	Open source software. FIJI version including plug in package.
Vector image editor	Adobe	Illustrator CS4
Spreadsheet application	Microsoft Office	Excel 2010