تحليل في الحجم والشكل واتجاهية شبكات من أستروسيتيس إلى جانب
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتقييم المنظمة لشبكات أستروسيتيك. الأسلوب وصف يقلل من التحيز لتوفير تدابير وصفية لهذه الشبكات مثل عدد الخلايا، وحجم ومجال والموقف داخل نواة. ويتم تقييم تباين مع تحليل اتجاهي.
Abstract
أصبح من الواضح بشكل متزايد أن astrocytes تعدل وظيفة الخلايا العصبية ليس فقط على الصعيدين متشابك وخلية واحدة، ولكن أيضا على مستوى الشبكة. أستروسيتيس ترتبط بشدة ببعضها البعض من خلال تقاطعات الفجوة واقتران من خلال هذه الوصلات الديناميكية وعالية التنظيم. مفهوم الناشئ هو أن أستروسيتيك وظائف متخصصة وتتكيف مع مهام الدوائر العصبية التي ترتبط. ولذلك، تلزم أساليب لقياس بارامترات مختلفة من الشبكات أستروسيتيك لوصف أفضل القواعد الناظمة للاتصال بهم واقتران وكذلك فهم وظائفها.
هنا، باستخدام برمجيات تحليل الصورة (مثلاً.، إيماجيجفيجي)، يصف لنا طريقة لتحليل الصور [كنفوكل] شبكات أستروسيتيك كشفت عنها صبغة-اقتران. تسمح هذه الأساليب 1) الاكتشاف الآلي وغير متحيزة للخلايا المسماة، 2) حساب حجم الشبكة، 3) حساب التوجه تفضيلية لصبغ تنتشر داخل الشبكة، و 4) إعادة تنظيم شبكة الاتصال ضمن مجال الاهتمام .
يمكن استخدام هذا التحليل لتميز الشبكات أستروسيتيك لمنطقة معينة، وقارن الشبكات في مختلف المجالات المرتبطة بوظائف مختلفة، أو مقارنة الشبكات التي تم الحصول عليها تحت ظروف مختلفة التي لها تأثيرات مختلفة على اقتران. قد تؤدي هذه الملاحظات إلى أهمية الاعتبارات الفنية. على سبيل المثال، نحن نحلل شبكات نواة تريجمينل، حيث أننا أظهرنا سابقا أن اقتران أستروسيتيك ضروري للخلايا العصبية قادرة على تحويل أنماطها إطلاق النار من منشط ل انفجار إيقاعي1أستروسيتيك. عن طريق قياس حجم والحبس، والميول تفضيلية لشبكات أستروسيتيك في هذه النواة، يمكننا أن نبني فرضيات حول المجالات الوظيفية التي كانت تقيد. العديد من الدراسات تشير إلى أن عدة مناطق الدماغ الأخرى، منها اللحاء البرميل والزيتون متفوقة الأفقي، glomeruli حاسة الشم، والنوى الحسية في المهاد والقشرة البصرية، على سبيل المثال، قد تستفيد من تحليل مماثل.
Introduction
وقد وصف العديد من الدراسات كيف يمكن أن يكون الحوار أستروسيتي العصبية على مستوى الخلوي الفرعي أو متشابك الآثار في وظائف الخلايا العصبية وانتقال متشابك. ومن الثابت أن astrocytes حساسة إلى المحيطة بنشاط الخلايا العصبية؛ وفي الواقع، لديهم مستقبلات للعديد من أجهزة الإرسال العصبية بما في ذلك غلوتامات غابا، أستيل و ATP (انظر ملاحظات نشرت سابقا2،،من34). وفي المقابل، أستروسيتيك عمليات انشياث متشابك العناصر وتأثير نشاط الخلايا العصبية هناك وفي مواقع اكستراسينابتيك بتنظيم التوازن الأيونية خارج الخلية والإفراج عن عدة عوامل أو أجهزة الإرسال مثل الجلوتامات ود-سيرين ATP 5 , 6 , 7.
برزت فكرة أن أستروسيتيس يمكن أن تعدل أيضا وظيفة الخلايا العصبية على مستوى الشبكة، بدليل أن اقتران أستروسيتيك مكانياً وينظم ويناظر تقسيم الخلايا العصبية في المناطق التي تتسم تشريحي واضح تجزئة (مثل المناطق مع تمثيلات حسية)، مما يشير إلى أن أستروسيتيس سوف زوجين إلى astrocytes أخرى تخدم نفس الوظيفة وليس فقط تلك التي قريبة من. في الزيتون متفوقة الأفقي، على سبيل المثال، شبكات الأكثر أستروسيتيك تتجه أورثوجونالي إلى محور تونوتوبيك8، بينما في البرميل اللحاء أو أولفاكتوتي جلوميرولي، الاتصال بين astrocytes أقوى بكثير داخل براميل أو جلوميرولي والأضعف بين المجاورة منها9،10. وفي كلتا الحالتين، الشبكات أستروسيتيك تتجه نحو مركز9،جلوميرولي أو البرميل10.
ونحن مؤخرا أظهرت أن ينظم نشاط أستروسيتيك إطلاق الخلايا العصبية بتقليل تركيز Ca خارج الخلية2 + ([Ca2 +]ﻫ)، يفترض من خلال الإفراج عن S100β، Ca2 +-ملزمة البروتين11. في هذا الصدد، الذي تجلى في عدد من الخلايا العصبية رهيثموجينيك تريجمينل في الجزء الظهرية الحسية الرئيسية تريجمينل نواة (نفسنبر، ويعتقد أن تلعب دوراً هاما في توليد حركات ماستيكاتوري)، ناتج عن كون أن إطلاق الإيقاعي في هذه الخلايا العصبية يعتمد على استمرار نا+ الحالي الذي يتعزز بنقصان [Ca2 +]ه11،12. يمكن آثار إطلاق الإيقاعي في هذه الخلايا العصبية “فسيولوجيا” بالحث على مدخلاتها أو نقصان اصطناعية من [Ca2 +]ه. ونحن كذلك أظهرت أن اقتران أستروسيتيك المطلوبة لإطلاق الإيقاعي العصبية1. وهذا يثير إمكانية أن شبكات أستروسيتيك يمكن أن تشكل مجالات وظيفية محددة حيث يمكن مزامنة نشاط الخلايا العصبية وتنسيقها. لتقييم هذه الفرضية، نحن بحاجة أولاً وضع طريقة لتوثيق دقيق تنظيم هذه الشبكات داخل نفسنبر.
وقد وصف الدراسات السابقة على شبكات أستروسيتيك معظمهم مدى اقتران من حيث عدد الخلايا والكثافة والمنطقة التي تغطيها. أجريت محاولات لتقييم شكل شبكات أستروسيتيك والاتجاه لصبغ-اقتران معظمها بمقارنة حجم الشبكات على محورين (س وص) في البرميل اللحاء9،، الحصين13،14 15، حقول باريلويد المهاد16و الزيتون متفوقة الجانبي8، glomeruli حاسة الشم10، واللحاء14. الأساليب الموصوفة هنا تمكين التهم غير منحازة للخلايا المسماة في شبكة وتقدير من المنطقة التي تغطيها. كما قمنا بتطوير أدوات لتحديد اتجاه المفضل لاقتران ضمن شبكة، وتقييم ما إذا كان المفضل والتوجه نحو مركز نواة أو في اتجاه مختلف. بالمقارنة مع الأساليب المستخدمة سابقا، يوفر هذا البروتوكول وسيلة لوصف المنظمة والتوجه لشبكات أستروسيتيك في هياكل مثل نواة الحسية الرئيسية تريجمينل الظهرية التي ليس لديها معروف تشريحية واضحة التقسيم. في الدراسات المذكورة أعلاه، توجه شبكة توصف بأنها على علاقة بشكل البنية نفسها التي تم توثيقها بالفعل (على سبيل المثال-، باريلويد في المهاد، برميل في القشرة، والطبقات في قرن آمون وقشرة، وجلوميرولي في لمبة شمي، إلخ.). وبالإضافة إلى ذلك، يسمح تحليل اتجاهي لإجراء مقارنات لاقتران التوجهات كشفت تحت ظروف مختلفة. لتحليل ما إذا كان تغيير هذه المعلمات وفقا لموضع شبكة الاتصال داخل النواة، وضعنا أيضا طريقة لاستبدال الشبكة كل إشارة إلى حدود النواة. هذه الأدوات يمكن تكييفها بسهولة إلى مناطق أخرى لشبكات الخلايا إلى جانب التحقيق.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوجد عدد من الطرق الكهربية لتقييم وظيفي اقتران بين أستروسيتيس،من2324. ومع ذلك، هذه الأساليب لا توفر معلومات حول ترتيب التشريحية لشبكات أستروسيتيك. عدد من الدراسات قد أثبتت أن “صبغ-أو الراسم-اقتران”، كما فعل هنا، لا يحدث إلا في جزء صغير من إلى جانب الخلايا التي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويمول هذا العمل من “المعاهد الكندية للبحوث الصحية”، عدد المنح/جائزة: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control?. Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neurosciences. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101–Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
