Analysere størrelse, form og retning for indtastning af netværk af koblede astrocytter
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at vurdere organiseringen af astrocytic netværk. Den beskrevne metode minimerer bias for at give beskrivende foranstaltninger af disse netværk såsom celletal, størrelse, område og position inden for en kerne. Anisotropy vurderes med en vektorielle analyse.
Abstract
Det er blevet stadig mere klart, at astrocytter modulere neuronal funktion på synaptic og encellede niveau, men også på netværksniveau. Astrocytter er stærkt forbundet med hinanden gennem kløften vejkryds og kobling gennem disse knudepunkter er dynamisk og stærkt regulerede. Et spirende koncept er at astrocytic funktioner er specialiserede og tilpasset til funktionerne af neuronal kredsløbet som de er forbundet. Derfor er metoder til at måle forskellige parametre af astrocytic netværk for at bedre beskrive regler for deres kommunikation og kobling og til yderligere at forstå deres funktioner.
Her, ved hjælp af billede analyse software (fx., ImageJFIJI), vi beskriver en metode til at analysere Konfokal billeder af astrocytic netværk afsløret af farvestoffet-kobling. Disse metoder giver mulighed for 1) en automatiseret og upartiske påvisning af mærket celler, 2) beregningen af størrelsen af netværket, 3) beregning af de præferentielle orientering af farvestof spredes inden for netværket, og 4) Repositionering af netværk inden for området af interesse .
Denne analyse kan bruges til at karakterisere astrocytic netværk af et bestemt område, sammenligne net af forskellige områder knyttet til forskellige funktioner eller sammenligne netværk opnået under forskellige forhold, der har forskellige effekter på koblingen. Disse observationer kan føre til vigtige funktionelle overvejelser. For eksempel, analyserer vi de astrocytic net af en trigeminus kerne, hvor vi har tidligere vist, at astrocytic kobling er afgørende for neuroner evne til at skifte deres affyring mønstre fra tonic til rytmiske bristende1. Ved at måle størrelsen, indespærring og privilegerede orientering af astrocytic netværk i denne kerne, kan vi opbygge hypoteser om funktionelle domæner, at de afgrænse. Flere undersøgelser tyder på, at flere andre områder i hjernen, herunder tønde cortex, lateral superior olive, olfaktoriske glomeruli og sensoriske kerner i thalamus og visuel cortex, for at nævne et par stykker, kan drage fordel af en lignende analyse.
Introduction
Mange undersøgelser har beskrevet, hvordan dialogen neuron-astrocyte på subcellulære eller synaptic plan kan få konsekvenser i neuronal funktioner og synaptisk transmission. Det er godt etableret, astrocytter er følsomme over for omkring neuronal aktivitet; i virkeligheden, har de receptorer for mange neurotransmittere, herunder glutamat, GABA, acetylcholin, og ATP (Se tidligere offentliggjorte anmeldelser2,3,4). Til gengæld behandler astrocytic ensheath synaptic elementer og indflydelse neuronal aktivitet både der og på extrasynaptic websteder ved at regulere ekstracellulære ionisk homøostase og frigive flere faktorer eller sendere såsom glutamat, D-Serin og ATP 5 , 6 , 7.
Den idé, at astrocytter også kan modulere neuronal funktion på netværksniveau opstået med beviser at astrocytic kobling reguleres rumligt og svarer til neuronal segmentering i områder præget af en klart anatomisk opdelingen (ligesom områder med sensoriske repræsentationer), der angiver, at astrocytter vil koble til andre astrocytter, der betjener den samme funktion i stedet for kun dem, der er tæt på. I den laterale superior olive, eksempelvis er mest astrocytic netværk orienteret vinkelret på den tonotopic akse8, mens der i tønde cortex eller olfactoty glomeruli, kommunikation mellem astrocytter er meget stærkere inden for tønder eller glomeruli og svagere mellem tilstødende dem9,10. I begge tilfælde er de astrocytic netværk orienteret mod midten af den glomerule eller tønde9,10.
Vi viste for nylig, at astrocytic aktivitet modulerer neuronal fyring ved at mindske koncentrationen af ekstracellulære Ca2 + ([Ca2 +]e), formentlig via frigivelse af S100β, en Ca2 +-bindende protein11. Denne effekt, som blev påvist i en population af trigeminus rhythmogenic neuroner i den dorsale del af trigeminus main sensoriske kernen (NVsnpr, menes at spille en vigtig rolle i generation af masticatory bevægelser), skyldes faktum, rytmisk fyring i disse neuroner afhænger af en vedvarende Na+ aktuelle der er fremmet af falder [Ca2 +]e11,12. Rytmisk fyring i disse neuroner kan “fysiologisk” fremkaldes ved stimulation af deres input eller kunstig nedsættelse af [Ca2 +]e. Vi viste yderligere, at astrocytic kobling var påkrævet for neuronal rytmiske fyring1. Dette rejste muligheden at astrocytic netværk kan danne afgrænset funktionelle domæner hvor neuronal aktivitet kan synkroniseres og samordnes. For at vurdere denne hypotese, skulle vi først udvikle en metode til at dokumentere strengt organiseringen af disse net inden for NVsnpr.
Tidligere undersøgelser på astrocytic netværk har for det meste beskrives omfanget af kobling cell antal og tæthed og dækningsområde. Forsøg på at evaluere astrocytic netværk form og retning af dye-kobling var for det meste udføres ved at sammenligne størrelsen af netværk langs to akser (x og y) i den tønde cortex9, hippocampus13,14, 15, barreloid felter i thalamus16, lateral superior oliven8, olfaktoriske glomeruli10og cortex14. De metoder, der beskrives her aktiverer upartiske tællinger af mærket celler i et netværk og et skøn over det område, de dækker. Vi har også udviklet værktøjer til at definere den foretrukne orientering af kobling inden for et netværk og til at vurdere, om de foretrukne orientering er mod midten af kernen eller i en anden retning. I forhold til tidligere anvendte metoder giver denne protokol mulighed for at beskrive organisationen og orientering af astrocytic netværk i strukturer som den dorsale trigeminus vigtigste sensoriske kerne, der ikke har en kendt klart anatomisk opdelingen. I de ovennævnte undersøgelser, netværk orientering er beskrevet som en relation til formen af den struktur, som er allerede dokumenteret (fx., barreloid i thalamus, Tønder i cortex, lag i hippocampus og cortex, glomeruli i den olfaktoriske pære, osv.). Derudover vektorielt analyse giver mulighed for sammenligninger af kobling retningslinjer afsløret under forskellige betingelser. For at analysere, om disse parametre ændres efter placeringen af netværk inden for kernen, udviklet vi også en metode til at erstatte hver netværk i forhold til grænserne for kernen. Disse værktøjer kan let tilpasses til andre områder for behandlende netværk af koblede celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der findes en række elektrofysiologiske metoder til at vurdere funktionelle kobling mellem astrocytter23,24. Disse metoder giver imidlertid ikke oplysninger om de anatomiske arrangement af astrocytic netværk. En række undersøgelser har allerede vist, at “dye – eller tracer-kobling”, som gjort her, opstår kun i en brøkdel af kombineret celler, der er registreret af elektrofysiologiske metoder25,26<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er finansieret af den canadiske institutter for sundhedsforskning, Grants-tildeling nummer: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control?. Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neurosciences. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101–Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
