आकार, आकार, और युग्मित Astrocytes के नेटवर्क के दिशात्मकता का विश्लेषण
Summary
यहां हम astrocytic नेटवर्क के संगठन का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । वर्णित विधि इस तरह के सेल गिनती, आकार, क्षेत्र, और एक नाभिक के भीतर की स्थिति के रूप में इन नेटवर्क के वर्णनात्मक उपाय प्रदान करने के लिए पूर्वाग्रह को कम करता है । Anisotropy एक वैक्टर विश्लेषण के साथ मूल्यांकन किया है ।
Abstract
यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि astrocytes न केवल synaptic और एकल सेल स्तर पर, लेकिन यह भी नेटवर्क के स्तर पर ंयूरॉन समारोह मिलाना । Astrocytes जोरदार अंतर जंक्शनों के माध्यम से एक दूसरे से जुड़े हुए हैं और इन जंक्शनों के माध्यम से युग्मन गतिशील और अत्यधिक विनियमित है. एक उभरती हुई अवधारणा है कि astrocytic कार्यों विशेष और न्यूरॉन सर्किट के साथ वे जुड़े रहे हैं के कार्यों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । इसलिए, तरीके astrocytic नेटवर्क के विभिंन मापदंडों को मापने के लिए बेहतर अपने संचार और युग्मन शासी और आगे उनके कार्यों को समझने के नियमों का वर्णन की जरूरत है ।
यहां, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJFIJI) का उपयोग कर, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए astrocytic नेटवर्क के फोकल छवियों का विश्लेषण डाई-युग्मन द्वारा पता चला । इन तरीकों 1 के लिए अनुमति देते हैं) लेबल कोशिकाओं के एक स्वचालित और निष्पक्ष पता लगाने, 2) नेटवर्क के आकार की गणना, 3) नेटवर्क के भीतर डाई प्रसार के तरजीही अभिविन्यास की गणना, और 4) ब्याज के क्षेत्र के भीतर नेटवर्क की स्थिति .
इस विश्लेषण के लिए एक विशेष क्षेत्र के astrocytic नेटवर्क की विशेषता इस्तेमाल किया जा सकता है, अलग अलग कार्यों से जुड़े क्षेत्रों के नेटवर्क की तुलना, या विभिंन स्थितियों है कि युग्मन पर अलग प्रभाव है के तहत प्राप्त नेटवर्क की तुलना करें । इन टिप्पणियों महत्वपूर्ण कार्यात्मक विचार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, हम एक astrocytic के नेटवर्क का विश्लेषण, जहां हम पहले से पता चला है कि astrocytic युग्मन ंयूरॉंस की क्षमता के लिए आवश्यक है दिखाने के लिए टॉनिक से अपने फायरिंग पैटर्न के लिए लयबद्ध1फट । इस नाभिक में astrocytic नेटवर्क्स के आकार, परिशोधन, और अधिमानी अभिविन्यास को मापने के द्वारा, हम कार्यात्मक डोमेन के बारे में परिकल्पनाओं का निर्माण कर सकते हैं, जो वे circumscribe हैं । कई अध्ययनों से पता चलता है कि कई अंय मस्तिष्क क्षेत्रों, बैरल प्रांतस्था सहित, सुपीरियर जैतून, घ्राण glomeruli, और संवेदी नाभिक thalamus और दृश्य प्रांतस्था में, कुछ नाम, एक समान विश्लेषण से लाभ हो सकता है ।
Introduction
कई अध्ययनों में बताया गया है कि कैसे एक उप-सेलुलर या synaptic स्तर पर न्यूरॉन-astrocyte संवाद में ंयूरॉन कार्यों और synaptic संचरण में निहितार्थ हो सकते हैं । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि astrocytes आसपास के न्यूरॉन गतिविधि के प्रति संवेदनशील हैं; वास्तव में, वे ग्लूटामेट, गाबा, acetylcholine सहित कई न्यूरोट्रांसमीटर के लिए रिसेप्टर्स है, और एटीपी (पहले से प्रकाशित की समीक्षा2,3,4) देखें. बदले में, astrocytic प्रक्रियाओं ensheath synaptic तत्वों और प्रभाव ंयूरॉन गतिविधि दोनों वहां और extrasynaptic साइटों पर extracellular ईओण homeostasis विनियमन और कई कारकों या ऐसे ग्लूटामेट, डी के रूप में ट्रांसमीटर जारी serine, और एटीपी 5 , 6 , 7.
विचार है कि astrocytes भी नेटवर्क के स्तर पर ंयूरॉंस समारोह मिलाना कर सकते हैं, सबूत के साथ उभरा है कि astrocytic युग्मन विशेष रूप से विनियमित है और एक स्पष्ट संरचनात्मक द्वारा विशेषता क्षेत्रों में ंयूरॉन विभाजन से मेल खाती है compartmentalization (संवेदी अभ्यावेदन के साथ क्षेत्रों की तरह), यह दर्शाता है कि astrocytes अंय astrocytes के लिए कुछ नहीं बल्कि सिर्फ उन है कि द्वारा करीब है एक ही समारोह की सेवा करेंगे । पार्श्व सुपीरियर जैतून में, उदाहरण के लिए, सबसे astrocytic नेटवर्क tonotopic अक्ष8orthogonally उंमुख हैं, जबकि बैरल प्रांतस्था या olfactoty glomeruli में, astrocytes के बीच संचार बहुत बैरल या glomeruli के भीतर मजबूत है और आसंन लोगों के बीच कमजोर9,10। दोनों ही मामलों में, astrocytic नेटवर्क glomerule या बैरल9,10के केंद्र की ओर उन्मुख कर रहे हैं ।
हम हाल ही में दिखाया गया है कि astrocytic गतिविधि extracellular ca की एकाग्रता कम करके न्यूरॉन्स फायरिंग ढा+ ([ca2 +]ई), संभवतः S100β, एक Ca2 +-बाइंडिंग प्रोटीन11की रिहाई के माध्यम से. यह प्रभाव है, जो rhythmogenic के पृष्ठीय भाग में एक की आबादी में का प्रदर्शन किया गया था, जबकि NVsnpr के मुख्य संवेदी नाभिक (, masticatory आंदोलनों की पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सोचा), इस तथ्य से परिणाम है कि इन न्यूरॉन्स में लयबद्ध गोलीबारी एक निर्बाध ना पर निर्भर करता है+ वर्तमान है कि के द्वारा पदोंनत किया जाता है [Ca2 +]e11,12. इन न्यूरॉन्स में लयबद्ध गोलीबारी “शारीरिक रूप से” उनके आदानों या कृत्रिम कमी की उत्तेजना से [Ca2 +]ईको मिलाया जा सकता है । हम आगे पता चला है कि astrocytic युग्मन के लिए आवश्यक था ंयूरॉन लयबद्ध गोलीबारी1। यह संभावना है कि astrocytic नेटवर्क घिरा कार्यात्मक डोमेन फार्म कर सकते है उठाया, जहां ंयूरॉंस गतिविधि सिंक्रनाइज़ और समंवित किया जा सकता है । इस परिकल्पना का आकलन करने के लिए, हम पहले NVsnpr के भीतर इन नेटवर्क के संगठन को कड़ाई से दस्तावेज़ के लिए एक विधि विकसित करने की जरूरत है ।
astrocytic नेटवर्क पर पिछले अध्ययन ज्यादातर सेल संख्या के मामले में युग्मन की हद तक वर्णित है और घनत्व और क्षेत्र को कवर किया । astrocytic नेटवर्क के आकार और डाई-युग्मन की दिशा का मूल्यांकन करने के प्रयास ज्यादातर दो अक्षों के साथ नेटवर्क के आकार की तुलना द्वारा प्रदर्शन किया गया (x और y) बैरल प्रांतस्था9में, हिप्पोकैम्पस13,14, 15, thalamus16, पार्श्व सुपीरियर ओलिव8, घ्राण glomeruli10, और प्रांतस्था14के barreloid क्षेत्रों । यहां वर्णित विधियां किसी नेटवर्क में लेबल किए गए कक्षों की निष्पक्ष गिनती और वे कवर क्षेत्र का अनुमान सक्षम करती हैं । हम भी उपकरण विकसित करने के लिए एक नेटवर्क के भीतर युग्मन के पसंदीदा अभिविन्यास को परिभाषित करने और आकलन है कि पसंदीदा अभिविंयास नाभिक के केंद्र की ओर है या एक अलग दिशा में । पहले इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल एक ज्ञात स्पष्ट संरचनात्मक नहीं है कि पृष्ठीय astrocytic के मुख्य संवेदी नाभिक की तरह संरचनाओं में संगठन और अभिविंयास नेटवर्क का वर्णन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है compartmentalization । उपरोक्त अध्ययनों में, नेटवर्क अभिविन्यास संरचना के आकार के लिए एक संबंध के रूप में ही वर्णित है जो पहले से ही प्रलेखित है (जैसे, thalamus में barreloid, बैरल में प्रांतस्था, परतों में हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था, glomeruli में घ्राण बल्ब, आदि) । इसके अलावा, वैक्टर विश्लेषण युग्मन विभिंन स्थितियों के तहत पता चला झुकाव की तुलना के लिए अनुमति देता है । विश्लेषण करने के लिए कि क्या इन मापदंडों नाभिक के भीतर नेटवर्क की स्थिति के अनुसार बदल गया है, हम भी एक विधि नाभिक की सीमाओं के संदर्भ में प्रत्येक नेटवर्क को प्रतिस्थापित करने के लिए विकसित की है । इन उपकरणों को आसानी से युग्मित कोशिकाओं के नेटवर्क की जांच के लिए अंय क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
electrophysiological तरीकों की एक संख्या23astrocytes,24के बीच कार्यात्मक युग्मन का आकलन करने के लिए मौजूद हैं । हालांकि, इन पद्धतियों astrocytic नेटवर्क की संरचनात्मक व्यवस्था के बारे में जानकारी प्रदान नह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों द्वारा वित्त पोषित है, अनुदान/
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
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