Analizzando le dimensioni, la forma e la direzionalità delle reti dei Astrocytes accoppiato
Summary
Qui presentiamo un protocollo per valutare l’organizzazione di reti astrocytic. Il metodo descritto riduce al minimo la distorsione per fornire misure descrittivi di queste reti come il conteggio delle cellule, dimensioni, area e posizione all’interno di un nucleo. Anisotropia è valutato con un’analisi vettoriale.
Abstract
È diventato sempre più chiaro che gli astrociti modulano la funzione di un neurone non solo a livello sinaptico e cella singola, ma anche a livello di rete. Gli astrociti sono fortemente collegati tra loro attraverso giunzioni di gap e accoppiamento attraverso queste giunzioni è dinamico e altamente regolato. Un concetto emergente è che funzioni astrocytic sono specializzate e adattate per le funzioni del circuito neuronale a cui sono associati. Pertanto, metodi per misurare i vari parametri delle reti astrocytic sono necessari per meglio descrivere le regole che disciplinano la loro comunicazione e l’accoppiamento e per capire meglio le loro funzioni.
Qui, utilizzando il software di analisi di immagine (ad es., ImageJFIJI), descriviamo un metodo per analizzare immagini confocal di reti astrocytic rivelati da tintura-accoppiamento. Questi metodi consentono di 1) un rilevamento automatizzato e imparziale delle cellule con etichettate, 2) calcolo della dimensione della rete, 3) calcolo dell’orientamento preferenziale della tintura diffuse all’interno della rete e 4) riposizionamento della rete all’interno dell’area di interesse .
Questa analisi consente di caratterizzare astrocytic reti di una particolare area, confrontare reti di diverse aree associate a funzioni diverse o reti ottenute in condizioni diverse che hanno effetti diversi sull’accoppiamento. Queste osservazioni potrebbero portare a importanti considerazioni funzionali. Per esempio, analizziamo le reti astrocytic di un nucleo trigeminale, dove precedentemente abbiamo indicato che accoppiamento astrocytic è essenziale per la capacità dei neuroni di passare loro schemi di attivazione da tonico per rottura ritmica1. Misurando le dimensioni, confinamento e orientamento preferenziale delle reti astrocytic in questo nucleo, possiamo costruire ipotesi sui domini funzionali che circoscrivono. Parecchi studi suggeriscono che diverse altre aree cerebrali, tra cui la corteccia barile, oliva superiore laterale, glomeruli olfattivi e sensoriali nuclei nel talamo e corteccia visiva, per citarne alcuni, possono beneficiare di una simile analisi.
Introduction
Molti studi hanno descritto come il dialogo di neuroni-astrociti a livello sub-cellulare o sinaptico può avere implicazioni in funzioni neuronali e trasmissione sinaptica. È affermato che gli astrociti sono sensibili ai circostanti attività neuronale; Infatti, essi hanno recettori per neurotrasmettitori molti tra cui glutammato, GABA, acetilcolina e ATP (Vedi recensioni precedentemente pubblicate2,3,4). In cambio, astrocitari elabora elementi sinaptica Sheath e attività neuronale influenza entrambe c’e presso siti extrasynaptic regolazione dell’omeostasi ionica extracellulare e rilasciando diversi fattori o trasmettitori quali glutammato, D-serina e ATP 5 , 6 , 7.
L’idea che gli astrociti possono anche modulare la funzione di un neurone a livello di rete è emerso, con evidenza che accoppiamento astrocytic spazialmente è regolata e corrisponde a un neurone segmentazione in aree caratterizzate da un chiaro anatomico compartimentazione (come le zone con le rappresentazioni sensoriali), che indica che gli astrociti saranno accoppiare ad altri astrociti che servono la stessa funzione, piuttosto che solo quelli che sono nelle vicinanze. Nell’oliva superiore laterale, ad esempio, reti più astrocytic sono orientati ortogonalmente al tonotopico asse8, considerando che nei glomeruli barile corteccia o olfactoty, è molto più forte all’interno di botti o glomeruli comunicazione tra astrociti e più debole tra adiacente quelli9,10. In entrambi i casi, le reti astrocytic sono orientate verso il centro del glomerulo o canna9,10.
Recentemente abbiamo dimostrato che attività astrocytic modula il firing neuronale diminuendo la concentrazione di Ca extracellulare2 + ([Ca2 +]e), presumibilmente attraverso il rilascio di S100β, a Ca2 +-binding proteina11. Questo effetto, che è stato dimostrato in una popolazione di neuroni trigeminali rhythmogenic nella parte dorsale della sensitiva del trigeminal principale nucleo (NVsnpr, pensato per svolgere un ruolo importante nella generazione di movimenti masticatori), deriva dal fatto che ritmica infornamento in questi neuroni dipende da un Na persistente+ attuale che è promosso da diminuzioni della [Ca2 +]t11,12. Ritmica infornamento in questi neuroni può essere suscitata “fisiologicamente” da stimolazione dei loro ingressi o artificiale diminuzione della [Ca2 +]e. Abbiamo ulteriormente dimostrato che astrocytic accoppiamento è stato richiesto per firing neuronale ritmica1. Ciò ha sollevato la possibilità che reti astrocytic possono formare circoscritte domini funzionali dove le attività di un neurone può essere sincronizzato e coordinato. Per valutare questa ipotesi, abbiamo prima bisogno di sviluppare un metodo per documentare rigorosamente l’organizzazione di queste reti all’interno di NVsnpr.
Gli studi precedenti sulle reti astrocytic sono descritti principalmente nella misura dell’accoppiamento in termini di numero delle cellule e la densità e l’area coperta. Tentativi di valutare la forma delle reti astrocytic e la direzione della tintura-accoppiamento per la maggior parte sono stati eseguiti confrontando le dimensioni delle reti lungo due assi (x e y) nella canna corteccia9, ippocampo13,14, 15, barreloid campi il talamo16, laterale superiore oliva8, glomeruli olfattivi10e corteccia14. I metodi descritti qui abilitare imparziali conteggi delle cellule con etichettate in una rete e una stima dell’area che coprono. Abbiamo inoltre sviluppato strumenti per definire l’orientamento preferito di accoppiamento all’interno di una rete e per valutare se l’orientamento preferito è verso il centro del nucleo o in una direzione diversa. Rispetto ai metodi precedenti, questo protocollo fornisce un mezzo per descrivere l’organizzazione e l’orientamento delle reti astrocytic in strutture come il nucleo sensitivo principale del trigemino dorsale che non dispongono di un conosciuto Chiara anatomico compartimentalizzazione. Negli studi di cui sopra, l’orientamento della rete è descritto come una relazione tra la forma della struttura stessa che è già documentata (ad es., strati di barreloid nel talamo, barili nella corteccia, nell’ippocampo e nella corteccia, glomeruli in il bulbo olfattivo, ecc.). Inoltre, analisi vettoriale consente comparazioni di orientamenti ha rivelati in diverse condizioni di accoppiamento. Per analizzare se questi parametri cambiati secondo la posizione della rete all’interno del nucleo, abbiamo anche sviluppato un metodo per sostituire ogni rete in riferimento i confini del nucleo. Questi strumenti possono essere facilmente adattati ad altre aree per le reti d’istruttore delle cellule accoppiate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esiste un numero di metodi elettrofisiologici per valutare funzionale accoppiamento tra astrociti23,24. Tuttavia, questi metodi non forniscono informazioni circa la disposizione anatomica delle reti astrocytic. Una serie di studi hanno già dimostrato che “tintura – o tracciante-accoppiamento”, come fatto qui, si verifica solo in una frazione di accoppiato le cellule che vengono rilevate da metodi elettrofisiologici25,<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è finanziato da istituti canadesi di ricerca sanitaria, Grant/premio numero: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
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