Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.
Abstract
Tornou-se cada vez mais claro que os astrócitos modulam função neuronal não só a nível sináptico e célula única, mas também no nível da rede. Astrócitos são fortemente ligados uns aos outros através de junções e acoplamento através destes cruzamentos é dinâmico e altamente regulamentado. Um conceito emergente é que funções hamartomas são especializadas e adaptadas para as funções do circuito neuronal com o qual eles estão associados. Portanto, métodos para medir vários parâmetros das redes hamartomas são necessários para melhor descrever as regras que regem a sua comunicação e acoplamento e a entender melhor as suas funções.
Aqui, usando o software de análise de imagem (ex., ImageJFIJI), descrevemos um método para analisar imagens confocal de redes hamartomas reveladas pela tintura-acoplamento. Estes métodos permitem 1) uma detecção automatizada e imparcial de pilhas etiquetadas, 2) cálculo do tamanho da rede, 3) cálculo da orientação preferencial da tintura espalhar dentro da rede e 4) reposicionamento da rede dentro da área de interesse .
Esta análise pode ser usada para caracterizar redes hamartomas de uma determinada área, comparar as redes de diferentes áreas associadas a diferentes funções ou comparar redes obtidas em condições diferentes que têm efeitos diferentes sobre o acoplamento. Estas observações podem levar a importantes considerações funcionais. Por exemplo, analisamos as redes hamartomas de um núcleo trigeminal, onde anteriormente mostramos que hamartomas acoplamento é essencial para a capacidade dos neurônios mudar seus padrões de fuzilamento de tónico para ruptura rítmica1. Ao medir o tamanho, confinamento e orientação preferencial das redes hamartomas esse núcleo, podemos construir hipóteses sobre domínios funcionais que eles delimitam. Vários estudos sugerem que várias outras áreas do cérebro, incluindo o córtex de barril, oliva superior lateral, glomérulos olfativos e núcleos sensoriais no tálamo e no córtex visual, para citar alguns, podem beneficiar de uma análise semelhante.
Introduction
Muitos estudos têm descrito como o diálogo do neurônio-astrocyte em um nível celular sub ou sináptico pode ter implicações em funções neuronais e a transmissão sináptica. Está bem estabelecido que astrócitos são sensíveis ao redor de atividade neuronal; na verdade, eles possuem receptores para muitos neurotransmissores incluindo glutamato, GABA, acetilcolina e ATP (ver comentários publicados anteriormente2,3,4). Em troca, hamartomas processa sináptica elementos ensheath e influência de atividade neuronal ambos lá e em locais extrasynaptic regulação homeostase iónica extracelular e soltando vários fatores ou transmissores, tais como o glutamato, D-serina e ATP 5 , 6 , 7.
Surgiu a ideia de que astrócitos também podem modular a função neuronal no nível da rede, com evidências de que o acoplamento hamartomas espacialmente é regulamentado e corresponde à segmentação neuronal em áreas caracterizadas por uma clara anatômica compartimentação (como áreas com representações sensoriais), indicando que astrócitos combinar para outros astrócitos, servindo a mesma função, em vez de apenas aqueles que estão por perto. Na oliva superior lateral, por exemplo, redes mais hamartomas são orientadas ortogonalmente ao tonotopic eixo8, Considerando que em glomérulos barril córtex ou olfactoty, a comunicação entre os astrócitos é muito mais forte dentro de barris ou glomérulos e mais fraco entre adjacentes uns9,10. Em ambos os casos, as redes hamartomas são orientadas em direção ao centro do glomerule ou barril9,10.
Recentemente mostramos que a atividade hamartomas modula disparo neuronal, diminuindo a concentração de extracelular Ca2 + ([Ca2 +]e), presumivelmente através da liberação de S100β, uma Ca2 +-ligação proteína11. Este efeito, o que foi demonstrado em uma população de neurônios rhythmogenic trigeminal na parte dorsal das principais trigeminal sensorial núcleo (NVsnpr, pensado para desempenhar um papel importante na geração de movimentos de mastigação), resulta do fato de que fuzilamento rítmico nestes neurônios depende de um persistente at+ atual que é promovido por diminuições de [Ca2 +]11,e12. Fuzilamento rítmico nestes neurônios pode ser eliciado “fisiologicamente” estimulação de suas entradas ou diminuição artificial da [Ca2 +]e. Nós revelou ainda que hamartomas acoplamento foi necessário para acionamento rítmico neuronal1. Isso levantou a possibilidade que as redes hamartomas podem formar circunscritos domínios funcionais, onde a atividade neuronal pode ser sincronizada e coordenada. Para avaliar esta hipótese, precisamos primeiro desenvolver um método para documentar rigorosamente a organização destas redes dentro de NVsnpr.
Estudos anteriores sobre redes hamartomas principalmente descreveu a extensão do acoplamento em termos de número de célula e a densidade e a área coberta. As tentativas de avaliar a forma de redes hamartomas e a direção da tintura-acoplamento principalmente foram realizadas comparando o tamanho das redes ao longo de dois eixos (x e y) do barril córtex9, hipocampo13,14, 15, barreloid campos do tálamo16, oliva superior lateral8, glomérulos olfativos10e o córtex14. Os métodos descritos aqui permitem imparciais acusações de pilhas etiquetadas em uma rede e uma estimativa da área que eles cobrem. Também desenvolvemos ferramentas para definir a orientação preferencial do acoplamento dentro de uma rede e avaliar se a orientação preferencial é em direção ao centro do núcleo, ou em uma direção diferente. Em comparação com métodos utilizados anteriormente, este protocolo fornece um meio para descrever a organização e a orientação das redes hamartomas em estruturas como o núcleo sensorial principal trigeminal dorsal que não têm um conhecido clara anatômico compartimentalização. Nos estudos acima, a orientação de rede é descrita como uma relação com a forma da estrutura em si que já está documentada (ex., o barreloid no tálamo, barris no córtex, camadas no hipocampo e córtex, glomérulos em o bulbo olfatório, etc.). Além disso, análise vectorial permite comparações de orientações reveladas sob diferentes condições de acoplamento. Para analisar se estes parâmetros alterados de acordo com a posição da rede dentro do núcleo, nós também desenvolvemos um método para substituir cada rede em referência os limites do núcleo. Estas ferramentas podem ser facilmente adaptadas para outras áreas para investigar redes de células acopladas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existe um número de métodos eletrofisiológicos para avaliar funcional acoplamento entre astrócitos23,24. No entanto, esses métodos não fornecem informações sobre o arranjo anatômico das redes hamartomas. Vários estudos já mostraram que “corante ou marcador-acoplamento”, como feito aqui, ocorre apenas em uma fração de juntamente com as células que são detectadas por métodos eletrofisiológicos25,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é financiado por institutos canadenses de pesquisa saúde, Grant/prêmio número: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
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