Анализируя размер, форму и направленность сетей спаренных астроциты
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки Организации Астроцитарная сетей. Описан метод минимизирует смещения для предоставления описательного мер этих сетей таких клеток, размер, площадь и позиция в ядра. Анизотропия оценивается с векторного анализа.
Abstract
Она становится все более очевидным, что астроциты модулировать нейрональных функции не только на уровне синаптических и одной ячейки, но и на сетевом уровне. Астроциты тесно связаны друг с другом через разрыв соединения, и соединение через эти соединения является динамичной и жестко регулируемых. Формирующейся концепции, что Астроцитарная функции являются специализированными и адаптированы к функции нейронов цепи, с которой они связаны. Таким образом методы измерения различных параметров Астроцитарная сетей необходимо лучше описать правила, регулирующие их связи и соединения и для более глубокого понимания их функций.
Здесь, используя программное обеспечение для анализа изображения (например., ImageJFIJI), мы описываем метод для анализа конфокальный изображения Астроцитарная сетей, обнаруженных краситель муфта. Эти методы позволяют 1) автоматизированных и беспристрастной выявления помеченных клеток, 2) расчет размера сети, 3) вычисления преференциальных ориентации красителя распространяется в сети и 4) репозиционирования сети в области интересов .
Этот анализ может использоваться для характеризуют Астроцитарная сетей в конкретной области, сравнить сетей разных областей, связанных с различными функциями или сравнить сетей, полученные при различных условиях, которые имеют различные эффекты на муфты. Эти наблюдения могут привести к важным функциональными соображениями. Например мы анализируем Астроцитарная сетей ядра тройничного нерва, где мы ранее показали, что Астроцитарная муфта имеет важное значение для способности нейронов для переключения схем их стрельбы от тоник художественной разрывной1. Путем измерять размер, родов и преференциальных ориентации Астроцитарная сетей в этом ядре, мы можем построить гипотезы о функциональных домены, которые они ограничивают. Некоторые исследования предполагают, что несколько других областях мозга, включая ствол мозга, боковые превосходное оливковое, обонятельные клубочков и сенсорные ядра таламуса и зрительной коры, чтобы назвать несколько, могут извлечь выгоду из аналогичный анализ.
Introduction
Многие исследования были описаны как нейрон экзоцитоз диалог на уровне субклеточном или синаптических может иметь последствия в нейрональных функций и синаптической передачи. Хорошо известно, что астроциты чувствительны к окружающим нейронной активности; в самом деле они имеют рецепторы для многих нейромедиаторов, включая глутамата, ГАМК, ацетилхолин и СПС (см. ранее опубликованных отзывов2,,34). В свою очередь Астроцитарная процессы синаптической элементы ensheath и влияние нейронной активности там и на внесинаптического участках регулирующих внеклеточного ионного гомеостаза и освобождение нескольких факторов или приемник например глутамата, D-серина и СПС 5 , 6 , 7.
Возникла идея, что Астроциты также может модулировать нейрональных функции на уровне сети, с доказательства того, что Астроцитарная муфта пространственно регулируется и соответствует нейрональных сегментации в областях характеризуется ясно анатомические фрагментарность (как районы с сенсорными представлений), указывая, что астроциты будет пару других астроциты, обслуживающих те же функции, а не только те, которые находятся рядом с отелем. В боковых превосходное оливковое например, наиболее Астроцитарная сети ориентированы ортогонально к оси tonotopic8, тогда как в ствол мозга или olfactoty клубочков, связь между астроциты гораздо сильнее в бочках или клубочков и слабее между соседними те9,10. В обоих случаях Астроцитарная сети ориентированы на центр glomerule или ствол9,10.
Недавно мы показали, что Астроцитарная деятельность модулирует нейронов стрельбы путем снижения концентрации внеклеточного Ca2 + ([Ca2 +]e), предположительно путем выпуска S100β, Ca2 +-привязка белка11. Этот эффект, который был продемонстрирован в популяции нейронов тройничного нерва rhythmogenic в спинной части тройничного нерва основные сенсорные ядра (NVsnpr, думал играть важную роль в генерации жевательных движений), приводит к от факта что ритмичный огонь в этих нейронов, зависит от стойких Na+ текущий, способствует уменьшается [Ca2 +]e11,12. Ритмичный огонь в этих нейронов может вызвали «физиологически» путем стимуляции их вклада или искусственное снижение [Ca2 +]e. Мы показали также, что требуется для нейронов ритмичный огонь1Астроцитарная муфты. Это возникает возможность, что Астроцитарная сетей могут образовывать очерченную функциональные домены где нейронной активности могут быть синхронизированы и координации. Для оценки этой гипотезе, мы сначала необходимо разработать метод строго документ Организации этих сетей в пределах NVsnpr.
Предыдущие исследования в Астроцитарная сетях главным образом описал степень сцепления с точки зрения количества клеток и плотности и площадь. Попытки оценить форму Астроцитарная сетей и направление краситель муфта главным образом выполнялись путем сравнения размера сетей по двум осям (x и y) в ствол мозга9, гиппокамп13,14, 15, barreloid области таламуса16, боковые превосходное оливковое8, обонятельные клубочков10и коры14. Описанные здесь методы позволяют беспристрастной количество помеченных клеток в сети и оценки площади, которую они охватывают. Мы также разработали инструменты для определения предпочтительного ориентации сцепного устройства в сети и оценить, является ли предпочтительным ориентации к центру ядра или в другом направлении. По сравнению с ранее используемых методов этот протокол предоставляет средства для описания организации и ориентации Астроцитарная сетей в структурах как спинной тройничного нерва основные сенсорные ядра, которые не имеют известный ясно анатомические фрагментарность. В выше исследований, ориентации сети описан как отношения к форме сама структура, которая уже документально (например., barreloid в таламус, бочки в коре головного мозга, слои в гиппокампе и коры, клубочков в обонятельные луковицы и т.д.). Кроме того Векторный анализ позволяет для сравнения сцепления ориентаций показал в различных условиях. Чтобы проанализировать ли эти параметры изменены согласно позиции сети внутри ядро, мы также разработал метод для замены каждой сети, со ссылкой на границах ядра. Эти инструменты могут быть легко адаптирована в другие районы для расследования сетей спаренных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует целый ряд электрофизиологических методов для оценки функциональных сцепления между астроциты23,24. Однако эти методы не предоставляют информацию о механизме анатомические Астроцитарная сетей. В ряде исследований уже показали, что «краситель …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансируется Канадским институтов медицинских исследований, номер гранта /: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control?. Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neurosciences. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101–Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
