На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете
Summary
Этот протокол описывает метод для крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans на твердых носителях. Как альтернатива культур в жидкой среде этот протокол позволяет получать параметры различных масштабах культивирования на основе плиты. Это увеличивает сопоставимости результатов, опустив морфологических и метаболические различия между жидких и твердых носителей культуры.
Abstract
Культивирование Caenorhabditis elegans (C. elegans) на плиты агара крупномасштабных образом может быть длительным и трудным. Этот протокол описывает простой и недорогой метод, чтобы получить большое количество животных для изоляции белков приступить к западной помарки, масс-спектрометрии или дальнейшего протеомики анализов. Кроме того увеличение нематоды чисел для immunostainings и интеграции нескольких анализов на тех же условиях культивирования может легко быть достигнуто. Кроме того способствует передаче между пластинами с различных экспериментальных условиях. Общие методы в пластине культуры связаны с передачей одного C. elegans , используя провод платины и передачи населенных агар куски с помощью скальпеля. Однако с увеличением числа нематод, эти методы становятся слишком много времени. Этот протокол описывает крупномасштабных культуры C. elegans , включая многочисленные шаги для сведения к минимуму воздействия подготовки пробы на физиологии червя. Жидкости и касательное напряжение может изменить продолжительность жизни и метаболические процессы в C. elegans, таким образом, требует подробное описание критических шагов для получения надежных и воспроизводимых результатов. C. elegans является модельный организм, состоящий из нейрональных клеток до одной трети, но не хватает кровеносных сосудов, обеспечивая тем самым возможность исследовать исключительно нейрональных изменения независимо от сосудистых управления. Недавно ранние нейродегенеративные в диабетической ретинопатии был найден до сосудистых изменений. Таким образом C. elegans представляет особый интерес для изучения общих механизмов осложнений диабета. Например повышенное образование Расширенный гликирования конечных продуктов (в возрасте), и наблюдается реактивнооксигенных видов (ров), который можно воспроизвести находятся в C. elegans. Протоколы обработки образцов достаточного размера для широкого спектра исследований представлены здесь, подтверждается в исследовании диабета индуцированной биохимические изменения. В общем, этот протокол может быть полезным для исследования, требующие большого C. elegans чисел и в которых жидкость культура не подходит.
Introduction
Анализы белка, как Западная помарка или масс-спектрометрии, требуют миллиграмм белка. Этот выход требует крупномасштабного культивирования сотни C. elegans, которое может быть достигнуто культур в жидкой среде или на твердых носителях, передачи нематод промывкой. Жидкости и касательное напряжение Индуцирует экспрессию эпителиальных натриевых каналов (ENaC), которые могут увеличить осмотического стресса через увеличение поглощения натрия, потенциально изменяя продолжительность жизни C. elegans и затрагивающих Метаболический Анализ1 . Таким образом некоторые важнейшие шаги в этом протоколе для подхода, основанного на пластину принять снижение стресса, затрагивающих экспериментальной изменчивость во внимание. Жидкий культуры, с другой стороны, влияет на фенотип нематод и усложняет культуры и коллекции точное количество нематод2. Кроме того реактивные вещества могут быть изменены компоненты средств массовой информации и могут распространять неравномерно до достижения нематод. Относительно ограничения жидкости культуры этот протокол обеспечивает альтернативный подход к культивирования крупномасштабных образцов C. elegans.
C. elegans является модельный организм с сетью собственный 302 нейрональных клеток, составляющих одну треть всех его ячеек3. С момента ее введения в науку, многие гомологичные и orthologous генов были описаны, усиливая его значение как модель для медицинских исследований. Недавно доказательства для неврологических нарушений в диабетической ретинопатии, предшествующих сосудистых повреждений, была представлена4. C. elegans отсутствуют кровеносные сосуды, но содержит собственный нейронные сети, что делает его подходящей модели расследовать нейрональных изменения помимо сосудов. Таким образом C. elegans представляет особый интерес для изучения общих механизмов осложнений диабета. Биохимические изменения в диабетических осложнений включать формирование возрастов, которые также влияют на формирование ROS в ответ гипергликемии5. Возрастов находятся в C. elegans и способствовать повреждения нейронов6. Хронические заболевания часто бывают вызваны комплекс, polygenic процессы, требующие многопараметрических подхода для оценки их основных механизмов, как свидетельствует здесь с оценкой осложнений диабета. Этот протокол можно использовать для получения нескольких параметров одновременно, а также впоследствии. Повышение сопоставимости и воспроизводимость многопараметрических подхода могут быть достигнуты, опустив морфологических и метаболические различия между жидких и твердых носителей культуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой надежный подход для крупномасштабного культивирования C. elegans для получения количественных результатов. Выводы из литературы может быть реплицированы, как показано в Представитель результаты. Даже несмотря на то, что этот протокол для ко?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в пределах IRTG 1874 «Микрососудистых осложнений диабета» и CRC 1118 «Реактивных метаболитов как повод для диабетической поздних осложнений». C. elegans штаммов N2 и CL2166 были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440).
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
