Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Abstract

La coltura di Caenorhabditis elegans (c. elegans) in maniera su larga scala su piastre di agar possa essere che richiede tempo e difficile. Questo protocollo descrive un metodo semplice e poco costoso per ottenere un gran numero di animali per l’isolamento delle proteine di procedere con ulteriori analisi proteomica, spettrometria di massa o un western blot. Inoltre, un aumento dei numeri del nematode per immunostainings e l’integrazione delle analisi multiple sotto le stesse condizioni di coltura può essere raggiunto facilmente. Inoltre, un trasferimento tra piastre con differenti condizioni sperimentali è facilitato. Tecniche comuni nella cultura piastra coinvolgono il trasferimento di un singolo c. elegans utilizzando un filo di platino e il trasferimento di agar popolate pezzi usando un bisturi. Tuttavia, con l’aumento del nematode numeri, queste tecniche diventano eccessivamente lunghe. Questo protocollo descrive la coltura su grande scala di c. elegans compresi i numerosi passaggi per ridurre al minimo l’impatto della preparazione del campione sulla fisiologia del worm. Fluido e shear stress può modificare la durata di vita e processi metabolici in c. elegans, richiedendo così una descrizione dettagliata delle fasi critiche al fine di recuperare risultati affidabili e riproducibili. C. elegans è un organismo modello, costituito da cellule di un neurone per fino a un terzo, ma in mancanza di vasi sanguigni, fornendo così la possibilità di indagare esclusivamente alterazioni neuronali indipendente di controllo vascolare. Recentemente, neurodegenerazione precoce nella retinopatia diabetica è stata trovata prima di alterazioni vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Ad esempio, una formazione aumentata di glycation prodotti finiti avanzati (età) e specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono osservata, che si trovano in modo riproducibile in c. elegans. Protocolli di gestire campioni di dimensioni adeguate per uno spettro più ampio di indagini sono presentati qui, esemplificato dallo studio delle alterazioni biochimiche indotte da diabete. In generale, questo protocollo può essere utile per gli studi che richiedono grande c. elegans numeri e nella quale coltura liquida non è adatta.

Introduction

Analisi di proteine, come una macchia occidentale o spettrometria di massa, richiedono milligrammi di proteine. Questo rendimento richiede una coltura su grande scala delle centinaia di c. elegans, che possono essere compiute in coltura liquida o in terreni solidi trasferendo i nematodi mediante lavaggio. Fluido e shear stress induce l’espressione di canali epiteliale del sodio (ENaC), che potrebbe aumentare lo stress osmotico attraverso un maggiore assorbimento di sodio, potenzialmente alterare la durata della vita di c. elegans e che interessano analisi metaboliche¹ . Di conseguenza, alcuni passaggi critici nel presente protocollo per l’approccio basato su piastra prendere la riduzione dello stress che colpiscono la variabilità sperimentale in considerazione. Coltura liquida, d’altra parte, influenza il fenotipo dei nematodi e complica la cultura e la raccolta di un numero esatto di nematodi². Inoltre, sostanze reattive possono essere modificate da componenti multimediali e possono essere distribuito in modo non uniforme prima di raggiungere i nematodi. Per quanto riguarda le limitazioni della coltura liquida, questo protocollo fornisce un approccio alternativo alla coltura campioni su larga scala di c. elegans.

C. elegans è un organismo di modello con una rete distinto di cellule neuronali 302, che costituiscono un terzo di tutte le sue cellule³. Sin dalla sua introduzione in scienza, molti omologhi e geni ortologhi sono state descritte, amplificando il suo valore come un modello per la ricerca medica. Recentemente, la prova per danno neurologico nella retinopatia diabetica, prima del danno vascolare, è stata presentata⁴. C. elegans è privo di vasi sanguigni, ma contiene una rete neuronale distinta, che lo rende un modello adatto per studiare alterazioni neuronali a parte quelle vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Le alterazioni biochimiche nelle complicazioni diabetiche comportano la formazione di età, che influenzano ulteriormente la formazione di ROS in risposta all’iperglicemia⁵. Età si trovano in c. elegans e contribuire al danno neuronale⁶. Malattie croniche sono spesso causate da processi complessi, poligenici che richiedono un approccio multiparametrico per la valutazione dei loro meccanismi di fondo, come esemplificato qui con la valutazione delle complicazioni diabetiche. Questo protocollo può essere utile per ottenere più parametri simultaneamente, così come successivamente. Una maggiore comparabilità e riproducibilità di un approccio multiparametrico si ottengono omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Protocol

Nota: Questo protocollo è diviso in cinque sezioni. Punti 1-3, è presentato il protocollo principale alla cultura c. elegans a larga scala. Sezioni 4 e 5 forniscono ulteriori protocolli per la valutazione dei metaboliti esemplificati che accadono in metaboliti diabetiche. In dettaglio, sezione 1 descrive una cultura generale su larga scala sulle piastre. Sezione 2 si concentra sul trasferimento di grandi quantità di c. elegans, considerando che la sezione 3 spiega la raccolta di un campione su larga …

Representative Results

Qui esempi di creazione di una larga scala di c. elegans della coltura per applicazioni nella ricerca del diabete sono presentate. Può essere di interesse per correlare i parametri di un singolo animale, piuttosto che per normalizzare e alla concentrazione di proteine totali. In un’analisi che richiedono un piccolo numero di nematodi, questo può essere facilmente realizzata contando i nematodi. Per una larga scala di c. elegans cultura coinvolgendo centinaia di nematod…

Discussion

Questo protocollo presenta un metodo affidabile per la coltura su grande scala di c. elegans per ottenere risultati quantitativi. I risultati dalla letteratura possono essere replicati come mostrato nei Risultati di rappresentante. Anche se questo protocollo per la raccolta di campioni su larga scala di c. elegans sembra un metodo semplice, ci sono certe insidie di prendere in considerazione. Per quanto riguarda la sincronizzazione della popolazione del nematode, questo protocollo descr…

Materials

E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.