Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.

Abstract

Kultivierung von Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) in einer großen Weise auf Agarplatten kann zeitraubend und schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode, um eine große Anzahl von Tieren für die Isolierung von Proteinen mit einem western-Blot, Massenspektrometrie oder weitere Proteomics Analysen fortfahren zu erhalten. Darüber hinaus können eine Erhöhung der Nematoden Zahlen für Immunostainings und die Integration von mehreren Analysen unter den gleichen Bedingungen Kultivierung leicht erreicht werden. Darüber hinaus wird eine Übertragung zwischen Platten mit verschiedenen experimentellen Bedingungen erleichtert. Allgemeine Techniken in der Platte Kultur beinhalten den Transfer von einem einzigen C. Elegans mit einem Platindraht und die Übertragung der besiedelten Agar Brocken mit einem Skalpell. Jedoch werden diese Techniken mit immer mehr Nematoden, allzu zeitaufwendig. Dieses Protokoll beschreibt die groß angelegte Kultur von C. Elegans einschließlich zahlreiche Schritte zur Minimierung der Auswirkungen der Probenvorbereitung auf die Physiologie des Wurms. Flüssigkeit und Schubspannung verändern können die Lebensdauer und Stoffwechselprozesse in C. Elegans, erfordern somit eine detaillierte Beschreibung der kritischen Schritte um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse abzurufen. C. Elegans ist ein Modellorganismus, bestehend aus neuronalen Zellen bis zu ein Drittel, aber fehlen Blutgefäße, wodurch die Möglichkeit, unabhängig von vaskulären Kontrolle ausschließlich neuronale Veränderungen zu untersuchen. Vor kurzem wurde Anfang Neurodegeneration bei diabetischer Retinopathie vor der vaskulären Veränderungen gefunden. C. Elegans ist daher von besonderem Interesse für das Studium allgemeine Mechanismen der diabetischen Komplikationen. Zum Beispiel eine erhöhte Bildung von advanced Glycation Endprodukte (Alter) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) beobachtet, die reproduzierbar in C. Eleganszu finden sind. Protokolle, Proben von ausreichender Größe für ein breiteres Spektrum an Untersuchungen zu behandeln sind hier vorgestellt am Beispiel der Studie von Diabetes-induzierte biochemische Veränderungen. In der Regel dieses Protokolls kann nützlich sein für Studien erfordern große C. Elegans Zahlen und in welcher Flüssigkultur nicht geeignet ist.

Introduction

Protein-Analysen, wie ein western-Blot oder Massenspektrometrie, erfordern Milligramm des Proteins. Diese Ausbeute erfordert eine großflächige Kultivierung von Hunderten von C. Elegans, die Flüssigkultur oder auf festen Medien übertragen die Nematoden durch Waschen erreicht werden kann. Flüssigkeit und Schubspannung induziert die Expression von epithelialen Natriumkanälen (ENaC), die den osmotischen Stress durch eine erhöhte Aufnahme von Natrium, möglicherweise die Lebensdauer von C. Elegans zu verändern und die Auswirkungen auf metabolische Analysen^{1 erhöhen könnte} . Daher nehmen einige wichtige Schritte in diesem Protokoll für die Platte basierenden Ansatz die Reduzierung von Stress Auswirkungen auf experimentelle Variabilität zu berücksichtigen. Flüssigkultur, auf der anderen Seite beeinflusst den Phänotyp der Nematoden und erschwert die Kultur und die Sammlung von eine genaue Anzahl von Nematoden². Darüber hinaus reaktiven Substanzen von Medienkomponenten veränderbar und können vor Erreichen der Nematodes ungleichmäßig verteilen. Über die Grenzen der Flüssigkultur bietet dieses Protokoll einen alternativen Ansatz zur Kultivierung großer Proben von C. Elegans.

C. Elegans ist ein Modellorganismus mit einem deutlichen Netzwerk von 302 Nervenzellen, aus denen ein Drittel aller seiner Zellen³. Seit seiner Einführung in die Wissenschaft, viele homologe und ortholog Gene wurden beschrieben, seinen Wert als Modell für die medizinische Forschung zu verstärken. Vor kurzem präsentierte Beweise für neurologische Beeinträchtigung bei diabetischer Retinopathie, vor Gefäßschädigungen,⁴. C. Elegans fehlt Blutgefäße, sondern enthält ein unterschiedliches neuronales Netzwerk, so dass es ein geeignetes Modell abgesehen von vaskulären, neuronale Veränderungen zu untersuchen. C. Elegans ist daher von besonderem Interesse für das Studium allgemeine Mechanismen der diabetischen Komplikationen. Biochemische Veränderungen im diabetischen Komplikationen betreffen die Bildung von Altersgruppen, die weiter die Bildung von ROS in Reaktion auf Hyperglykämie^{5 beeinflussen}. Altersgruppen finden sich in C. Elegans und tragen zur neuronalen Schaden⁶. Chronische Krankheiten entstehen oft durch komplexe, Polygene Prozesse erfordern einen multiparametric Ansatz für die Bewertung ihrer zugrunde liegenden Mechanismen, wie hier bei der Bewertung von diabetischen Komplikationen. Dieses Protokoll kann der Einsatz für den Erhalt mehrerer Parameter gleichzeitig, sowie anschließend sein. Erhöhte Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit eines multiparametric Ansatzes können durch Weglassen der morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen der flüssigen und festen Medienkultur erreicht werden.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll ist in fünf Abschnitte unterteilt. In den Abschnitten 1 – 3 ist das wichtigste Protokoll zu C. Elegans auf eine groß angelegte Kultur vorgestellt. Abschnitte 4 und 5 bieten zusätzliche Protokolle für die Beurteilung der beispielhaft Metaboliten in diabetischen Metaboliten auftritt. Abschnitt 1 beschreibt im Detail eine groß angelegte Allgemeinbildung auf Tellern. Abschnitt 2 konzentriert sich auf die Übertragung von großen Mengen von C. Elegans, während Kapitel 3 erkl…

Representative Results

Hier Kultur Beispiele der Schaffung eines groß angelegten C. Elegans für Anwendungen in der Diabetes-Forschung präsentiert werden. Es ist von Interesse, die Parameter beziehen sich auf ein einziges Tier, anstatt auf die Gesamt-Protein-Konzentration zu normalisieren. In einer Probe, eine kleine Anzahl von Nematoden erfordert kann dies leicht durch zählen der Nematodes erfolgen. Für eine groß angelegte C. Elegans Kultur mit Hunderten von Nematoden pro Versuchsgruppe,…

Discussion

Dieses Protokoll stellt einen zuverlässige Ansatz für die großflächige Kultivierung von C. Elegans , quantitative Ergebnisse zu erzielen. Erkenntnisse aus der Literatur konnte repliziert werden, wie in den Vertreter Ergebnissegezeigt. Obwohl dieses Protokoll für die Sammlung von großen Proben von C. Elegans wie eine unkomplizierte Methode scheint, gibt es einige Fallstricke zu berücksichtigen. Über die Synchronisation der Nematoden Bevölkerung beschreibt dieses Protokoll einen …

Materials

E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.