थाली आधारित Caenorhabditis एलिगेंसकी बड़े पैमाने पर खेती: मधुमेह में चयापचय परिवर्तन के अध्ययन के लिए नमूना तैयारी
Summary
इस प्रोटोकॉल ठोस मीडिया पर Caenorhabditis एलिगेंस की बड़े पैमाने पर खेती के लिए एक विधि का वर्णन । तरल संस्कृति के लिए एक विकल्प के रूप में, इस प्रोटोकॉल प्लेट आधारित खेती के तहत विभिंन तराजू के मापदंडों को प्राप्त करने की अनुमति देता है । यह तरल और ठोस मीडिया संस्कृति के बीच रूपात्मक और चयापचय मतभेदों को छोड़ कर परिणामों की तुलना बढ़ जाती है ।
Abstract
संवर्धन Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) पर बड़े पैमाने पर तरीके से आगार प्लेटों समय लेने वाली और मुश्किल हो सकता है । इस प्रोटोकॉल एक पश्चिमी दाग, जन स्पेक्ट्रोमेट्री, या आगे प्रोटियोमिक् विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना करने के लिए प्रोटीन के अलगाव के लिए जानवरों की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए एक सरल और सस्ती विधि का वर्णन । इसके अलावा, immunostainings और एक ही संवर्धन शर्तों के तहत कई विश्लेषण के एकीकरण के लिए निमेटोड संख्या की वृद्धि आसानी से प्राप्त किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, विभिंन प्रायोगिक शर्तों के साथ प्लेटों के बीच एक स्थानांतरण की सुविधा है । प्लेट संस्कृति में आम तकनीक एक एलिगेंस एक प्लेटिनम तार का उपयोग कर और आबादी वाले आगर एक स्केलपेल का उपयोग कर हिस्सा के हस्तांतरण का स्थानांतरण शामिल है । हालांकि, निमेटोड संख्या बढ़ाने के साथ, इन तकनीकों पीढ़ी समय लेने वाली हो जाते हैं । इस प्रोटोकॉल कई कदम कृमि के फिजियोलॉजी पर नमूना तैयारी के प्रभाव को कम करने सहित सी एलिगेंस की बड़े पैमाने पर संस्कृति का वर्णन । द्रव और कतरनी तनाव की उंर और सी एलिगेंसमें चयापचय प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं, इस प्रकार महत्वपूर्ण कदम का एक विस्तृत वर्णन की आवश्यकता के लिए विश्वसनीय और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए । C. एलिगेंस एक मॉडल जीव है, एक तिहाई तक के लिए ंयूरॉन कोशिकाओं से मिलकर, लेकिन रक्त वाहिकाओं की कमी, इस प्रकार की संभावना को पूरी तरह से संवहनी नियंत्रण के स्वतंत्र न्यूरॉन परिवर्तन की जांच प्रदान । हाल ही में, मधुमेह रेटिनोपैथी में जल्दी neurodegeneration संवहनी परिवर्तन करने से पहले पाया गया था । इस प्रकार, सी एलिगेंस मधुमेह जटिलताओं के सामान्य तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि का है । उदाहरण के लिए, उन्नत glycation अंत उत्पादों (उम्र) और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का एक बढ़ा गठन मनाया जाता है, जो reproducibly सी एलिगेंसमें पाए जाते हैं । जांच के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए पर्याप्त आकार के नमूनों को संभालने के लिए प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत कर रहे हैं, मधुमेह के अध्ययन से प्रेरित जैव रासायनिक परिवर्तन उदाहरण. सामांय में, इस प्रोटोकॉल बड़ी सी. एलिगेंस संख्या की आवश्यकता है और जिसमें तरल संस्कृति उपयुक्त नहीं है अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है ।
Introduction
प्रोटीन विश्लेषण, जैसे कि एक पश्चिमी दाग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री, प्रोटीन की मिलीग्राम की आवश्यकता होती है । इस उपज के लिए सी. एलिगेंसके सैकड़ों की एक बड़े पैमाने संवर्धन की आवश्यकता है, जो या तो तरल संस्कृति या ठोस मीडिया पर धोने से सूत्रकृमि स्थानांतरित करने के लिए पूरा किया जा सकता है । द्रव और कतरनी तनाव उपकला सोडियम चैनलों की अभिव्यक्ति लाती है (ENaC), जो सोडियम की एक वृद्धि की बढ़ी के माध्यम से आसमाटिक तनाव में वृद्धि कर सकता है, संभावित सी. एलिगेंस की उम्र में फेरबदल और चयापचय विश्लेषण को प्रभावित1 . इसलिए, प्लेट आधारित दृष्टिकोण के लिए इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम खाते में प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को प्रभावित करने के तनाव की कमी ले । तरल संस्कृति, दूसरी ओर, सूत्रकृमि के phenotype को प्रभावित करता है और संस्कृति और सूत्रकृमि2की एक सटीक संख्या के संग्रह पेचीदा । इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील पदार्थ मीडिया घटकों द्वारा बदला जा सकता है और सूत्रकृमि तक पहुंचने से पहले असमान रूप से वितरित कर सकते हैं । तरल संस्कृति की सीमाओं के बारे में, इस प्रोटोकॉल सी. एलिगेंसके बड़े पैमाने पर नमूनों संवर्धन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है ।
C. एलिगेंस ३०२ न्यूरॉन कोशिकाओं के एक अलग नेटवर्क के साथ एक मॉडल जीव है, अपने सभी कोशिकाओं3में से एक तिहाई बनाने. विज्ञान में अपनी शुरूआत के बाद से, कई मुताबिक़ और orthologous जीन का वर्णन किया गया है, चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में अपने मूल्य बढ़ाना । हाल ही में, मधुमेह रेटिनोपैथी में स्नायविक हानि, पूर्ववर्ती संवहनी क्षति के लिए सबूत,4प्रस्तुत किया गया है । C. एलिगेंस रक्त वाहिकाओं की कमी है, लेकिन एक विशिष्ट ंयूरॉंस नेटवर्क शामिल है, यह एक उपयुक्त मॉडल संवहनी लोगों से अलग न्यूरॉन परिवर्तन की जांच करने के लिए बना । इस प्रकार, सी एलिगेंस मधुमेह जटिलताओं के सामान्य तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि का है । मधुमेह जटिलताओं में जैव रासायनिक परिवर्तन उंर के गठन, जो आगे hyperglycemia5के जवाब में ROS के गठन को प्रभावित शामिल है । आयु C. एलिगेंस में पाया जाता है और ंयूरॉन क्षति6में योगदान । पुराने रोगों अक्सर जटिल के कारण होते हैं, polygenic प्रक्रियाओं उनके अंतर्निहित तंत्र के आकलन के लिए एक multiparametric दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है, के रूप में मधुमेह जटिलताओं के आकलन के साथ यहाँ उदाहरण. इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई मापदंडों को एक साथ प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही बाद में । वृद्धि की तुलना और एक multiparametric दृष्टिकोण के reproducibility तरल और ठोस मीडिया संस्कृति के बीच रूपात्मक और चयापचय मतभेदों को छोड़ कर प्राप्त किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल C. एलिगेंस के बड़े पैमाने संवर्धन के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण को मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत करता है । प्रतिनिधि परिणामोंमें दर्शाए अनुसार साहित्य से निष्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन IRTG १८७४ के भीतर ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था “मधुमेह microvascular जटिलताओं” और सीआरसी १११८ “मधुमेह देर से जटिलताओं के लिए एक कारण के रूप में प्रतिक्रियाशील चयापचयों”. C. एलिगेंस उपभेदों N2 और CL2166 CGC द्वारा प्रदान किए गए, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (NIH P40) के OD010440 कार्यालय द्वारा वित्तपोषित है.
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
