Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Summary

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Abstract

Cultivo Caenorhabditis elegans (c. elegans) de uma forma em grande escala em placas de ágar-ágar pode ser demorado e difícil. Este protocolo descreve um método simples e de baixo custo para obter um grande número de animais para o isolamento de proteínas para prosseguir com um western blot, espectrometria de massa ou novas análises proteômica. Além disso, um aumento de números de nematoides para immunostainings e a integração de múltiplas análises sob as mesmas condições de cultivo podem facilmente ser alcançados. Além disso, uma transferência entre placas com diferentes condições experimentais é facilitada. Técnicas comuns na cultura de placa envolvem a transferência de um único c. elegans , usando um fio de platina e a transferência de ágar povoada pedaços usando um bisturi. No entanto, com o aumento do número de nematoides, essas técnicas se tornar excessivamente demoradas. Este protocolo descreve a cultura em grande escala de c. elegans incluindo numerosas medidas para minimizar o impacto da preparação amostra sobre a fisiologia do worm. Fluido e tensão de cisalhamento podem alterar o tempo de vida de e processos metabólicos em c. elegans, exigindo assim uma descrição detalhada das etapas críticas para recuperar resultados confiáveis e reprodutíveis. C. elegans é um organismo modelo, constituído por células neuronais para até um terço, mas falta os vasos sanguíneos, proporcionando assim a possibilidade de investigar unicamente neuronais alterações independentes de controle vascular. Recentemente, descobriu-se cedo neurodegeneração retinopatia diabética antes alterações vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. Por exemplo, uma maior formação de avançados de glicação produtos finais (idades) e espécies reativas de oxigênio (ROS) é observada, que se encontram reproducibly em c. elegans. Protocolos para lidar com amostras de tamanho adequado para um amplo espectro de investigações são aqui apresentados, exemplificado pelo estudo da diabetes induzido por alterações bioquímicas. Em geral, este protocolo pode ser útil para estudos que exigem grande c. elegans números e em qual cultura líquida não é adequada.

Introduction

Análise de proteína, como um borrão ocidental ou espectrometria de massa, exige mg de proteína. Este rendimento requer um cultivo em grande escala de centenas de c. elegans, que pode ser feito por cultura líquida ou em meios sólidos, transferir os nematódeos por lavagem. Fluido e tensão de cisalhamento induz a expressão dos canais de sódio epitelial (ENaC), que poderia aumentar o estresse osmótico através de um aumento da absorção de sódio, potencialmente alterando o tempo de vida de c. elegans e afetando análises metabólicas¹ . Portanto, algumas etapas críticas neste protocolo para a abordagem baseada em placa leva a redução de estresse que afetam a variabilidade experimental em conta. Cultura líquida, por outro lado, influencia o fenótipo dos nematódeos e complica a cultura e a coleção de um número exato de nematoides². Além disso, substâncias reativas podem ser alteradas pelos componentes de mídia e podem distribuir irregularmente antes de atingir os nematoides. Sobre as limitações da cultura líquida, este protocolo fornece uma abordagem alternativa para cultivo em grande escala amostras de c. elegans.

C. elegans é um organismo modelo com uma rede distinta de 302 células neuronais, inventando um terço de todas as suas células³. Desde a sua introdução em ciência, muitos homólogas e genes ortólogos têm sido descritos, ampliando seu valor como um modelo para pesquisa médica. Recentemente, evidências de comprometimento neurológico em retinopatia diabética, precedendo a lesão vascular, foi apresentada⁴. C. elegans é desprovido de vasos sanguíneos, mas contém uma rede neuronal distinta, tornando-se um modelo adequado para investigar alterações neuronais além aqueles vasculares. Assim, o c. elegans é de especial interesse para o estudo de mecanismos gerais de complicações do diabético. As alterações bioquímicas em complicações do diabético envolvem a formação de idades, que mais influenciam a formação de ROS em resposta à hiperglicemia⁵. As idades encontram-se em c. elegans e contribuam para o dano neuronal⁶. Doenças crônicas são frequentemente causadas por processos complexos, poligênicos, exigindo uma abordagem Multiparamétrico para a avaliação de seus mecanismos subjacentes, como exemplificado aqui com a avaliação de complicações do diabético. Este protocolo pode ser útil para a obtenção de vários parâmetros simultaneamente, bem como posteriormente. Maior comparabilidade e reprodutibilidade de uma abordagem Multiparamétrico podem ser alcançados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Protocol

Nota: Este protocolo é dividido em cinco seções. Nas seções 1-3, é apresentado o protocolo principal à cultura de c. elegans em larga escala. Nas secções 4 e 5 fornecem protocolos adicionais para a avaliação dos metabolitos exemplificadas ocorrendo em metabólitos diabéticos. No detalhe, seção 1 descreve uma cultura geral em larga escala em placas. Secção 2 centra-se sobre a transferência de grandes quantidades de c. elegans, Considerando que a seção 3 explica que a colheita de uma am…

Representative Results

Aqui exemplos de criação de uma grande escala de c. elegans cultura para aplicações em pesquisa do diabetes são apresentadas. Pode ser de interesse para relacionar os parâmetros de um único animal, ao invés de normalizar isso à concentração de proteínas totais. Em um ensaio que exige um pequeno número de nematoides, isso pode ser facilmente realizado pela contagem dos nemátodes. Para uma grande escala de c. elegans cultura envolvendo centenas de nematoides …

Discussion

Este protocolo apresenta uma abordagem confiável para o cultivo em grande escala de c. elegans , obter resultados quantitativos. Achados da literatura poderiam ser replicados como mostrado nos Resultados de representante. Mesmo que este protocolo para a recolha de amostras em grande escala de c. elegans parece ser um método direto, há certas armadilhas para ter em conta. Sobre a sincronização da população de nematoides, este protocolo descreve uma abordagem por branqueamento da p…

Materials

E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.