Tallrik-baserade storskalig odling av Caenorhabditis elegans: provberedning för studie av metabola förändringar i Diabetes

Summary

Det här protokollet beskriver en metod för storskalig odling av Caenorhabditis elegans på solid media. Som ett alternativ till flytande kultur tillåter detta protokoll att erhålla parametrar för olika skalor under plattan-baserade odling. Detta ökar jämförbarheten av resultaten genom att utelämna de morfologiska och metabola skillnaderna mellan flytande och fasta mediekultur.

Abstract

Odling Caenorhabditis elegans (C. elegans) på ett omfattande sätt på agarplattor kan vara tidskrävande och svårt. Det här protokollet beskriver en enkel och billig metod för att få ett stort antal djur för isolering av proteiner att gå vidare med en western blot, masspektrometri eller ytterligare proteomik analyser. Dessutom kan en ökning av nematoder siffror för immunostainings och integration av flera analyser på samma culturing villkor lätt uppnås. Dessutom underlättas en överföring mellan plattor med olika experimentella förhållanden. Vanliga tekniker i plattan kultur innebär överföring av en enda C. elegans med en platina tråd och överföring av befolkade agar bitar med en skalpell. Men med ökande nematoder, blivit dessa tekniker alltför tidskrävande. Det här protokollet beskriver den storskaliga kulturen i C. elegans inklusive många steg för att minimera effekterna av provberedningen på fysiologi av masken. Vätska och skjuvspänning kan förändra livslängd och metaboliska processer i C. elegans, vilket kräver en detaljerad beskrivning av de kritiska steg för att hämta tillförlitliga och reproducerbara resultat. C. elegans är en modellorganism, bestående av neuronala celler för upp till en tredjedel, men saknar blodkärl, vilket ger möjligheten att undersöka enbart neuronala förändringar oberoende av vaskulär kontroll. Nyligen hittades tidigt neurodegeneration i diabetesretinopati före vaskulära förändringar. Således, C. elegans är av särskilt intresse för att studera generella mekanismer av diabeteskomplikationer. Till exempel en ökad bildning av advanced glycation end produkter (åldrar) och reaktiva syreradikaler (ROS) observeras, som reproducibly finns i C. elegans. Protokoll att hantera prover av tillräcklig storlek för ett bredare spektrum av undersökningar presenteras här exemplifieras med studier av diabetes-inducerad biokemiska förändringar. I allmänhet, detta protokoll kan vara användbara för undersökningar som kräver stor C. elegans nummer och i vilket flytande kultur inte är lämplig.

Introduction

Protein analyser, såsom en western blot eller masspektrometri, kräver milligram protein. Denna avkastning kräver en storskalig odling av hundratals C. elegans, som kan utföras antingen av flytande kultur eller på solid media överföra nematoder genom tvättning. Vätska och skjuvspänning inducerar uttryck av epitelial natriumkanaler (ENaC), vilket skulle kunna öka den osmotisk stressen genom ett ökat upptag av natrium, potentiellt förändra C. elegans livslängd och påverkar metabola analyser¹ . Därför ta vissa kritiska steg i detta protokoll för den platta-baserade strategin minskning av stress som påverkar experimentella variabilitet hänsyn. Flytande kultur, däremot, påverkar fenotypen av nematoder och komplicerar kultur och samling av ett exakt antal nematoder². Dessutom reaktiva ämnen kan ändras genom media-komponenter och kan distribuera ojämnt innan den når nematoder. Om begränsningar av flytande kultur ger det här protokollet en alternativ strategi för odling storskaliga prover av C. elegans.

C. elegans är en modellorganism med ett distinkt nätverk av 302 neuronala celler, som utgör en tredjedel av alla dess celler³. Sedan introduktionen i vetenskap, många homologa och orthologous gener har beskrivits, förstärka dess värde som en modell för medicinsk forskning. Bevis för neurologisk försämring av diabetisk retinopati, föregår kärlskador, har nyligen presenterats⁴. C. elegans saknas blodkärl, men innehåller ett distinkt neuronala nätverk, gör det en passande modell att undersöka neuronala förändringar förutom vaskulär ettor. Således, C. elegans är av särskilt intresse för att studera generella mekanismer av diabeteskomplikationer. Biokemiska förändringar i diabeteskomplikationer innebär bildandet av åldrar, vilket ytterligare påverkar bildningen av ROS svar på hyperglykemi⁵. Åldrar finns i C. elegans och bidra till nervcellskador⁶. Kroniska sjukdomar orsakas ofta av komplexa, polygenisk processer som kräver en multiparametric metod för bedömning av deras bakomliggande mekanismer, som exemplifieras här med bedömning av diabeteskomplikationer. Detta protokoll kan vara till nytta för att erhålla flera parametrar samtidigt, samt därefter. Ökad jämförbarhet och reproducerbarhet av ett multiparametric synsätt kan uppnås genom att utelämna de morfologiska och metabola skillnaderna mellan flytande och fasta mediekultur.

Protocol

Obs: Detta protokoll är indelad i fem sektioner. I avsnitt 1 – 3, presenteras huvudsakliga protokollet till kultur C. elegans på en storskalig. Avsnitten 4 och 5 ger ytterligare protokoll för bedömning av exemplifieras metaboliter förekommer hos diabetiker metaboliter. I detalj beskriver avsnitt 1 en storskalig allmänbildning på tallrikar. Avsnitt 2 fokuserar på överföring av stora mängder C. elegans, medan avsnitt 3 förklarar skörd av en storskalig provet. Avsnitt 4 förklarar protein is…

Representative Results

Här kultur exempel på att skapa en storskalig C. elegans för tillämpningar inom diabetesforskning presenteras. Det kan vara av intresse att relatera parametrarna till ett enda djur, snarare än att normalisera det totalprotein koncentrationen. I ett test som kräver ett litet antal nematoder, kan detta enkelt åstadkommas genom att räkna nematoder. För en storskalig C. elegans kultur som omfattar hundratals nematoder per experimentella gruppen, detta tillvägagång…

Discussion

Detta protokoll utgör en tillförlitlig strategi för storskalig odling av C. elegans få kvantitativa resultat. Resultaten från litteraturen kunde replikeras som visas i Representativa resultat. Även om detta protokoll för storskalig provtagning av C. elegans verkar vara en enkel metod, finns det vissa fallgropar att beakta. Om synkronisering av nematoder befolkningen beskriver det här protokollet en strategi genom blekning befolkningen med natriumhypoklorit och natriumhydroxid f?…

Materials

E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.