SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln
Summary
Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.
Abstract
Zellseneszenz ist eines der Kennzeichen des Alterns bekannt, um eine gesunde Lebensdauer negativ beeinflussen. Medikamente, die in der Lage sind, seneszente Zellen speziell in der Zellkultur zu töten, als Sennolytika bezeichnet, können die seneszente Zellbelastung in vivo reduzieren und die Gesundheitsspanne verlängern. Mehrere Klassen von Senolytika wurden bisher identifiziert, einschließlich HSP90-Inhibitoren, Bcl-2-Familieninhibitoren, Piperlongumin, einem FOXO4-hemmenden Peptid und der Kombination von Dasatinib/Quercetin. Der Nachweis von SA-A-Gal bei einem erhöhten lysosomalen pH-Wert ist einer der am besten charakterisierten Marker für den Nachweis von seneszenten Zellen. Live-Zellmessungen der seneszenzassoziierten Aktivität von Seneszenz-assoziierten B-Galactosidase (SA—Gal) mit dem fluoreszierenden Substrat C12FDG in Kombination mit der Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels eines DNA-interkalierenden Hoechst-Farbstoffs eröffnet Bildschirm auf senotherapeutische Medikamente, die entweder die gesamte SA-A-Gal-Aktivität durch Tötung von seneszenten Zellen (Senestik) reduzieren oder sA–Gal und andere Phänotypen von seneszenten Zellen (Senosozien) unterdrücken. Die Verwendung einer fluoreszierenden Bildaufnahme- und Analyseplattform mit hohem Gehalt ermöglicht das schnelle Screening von Medikamentenbibliotheken mit hohem Durchsatz auf Effekte auf SA–Gal, Zellmorphologie und Zellzahl.
Introduction
Die Zellseneszenz wurde zum ersten Mal von Leonard Hayflick und Paul Moorhead beschrieben, die zeigten, dass normale Zellen eine begrenzte Fähigkeit hatten, sich in Kultur1zu vermehren. Seneszenzzellen vermehren sich trotz des Vorhandenseins von Nährstoffen, Wachstumsfaktoren und mangelnder Kontakthemmung nicht, bleiben aber metabolisch aktiv2. Dieses Phänomen ist als replizierende Seneszenz bekannt und wurde hauptsächlich auf die Telomerverkürzung zurückgeführt, zumindest in menschlichen Zellen3. Weitere Studien haben gezeigt, dass Zellen auch als Reaktion auf andere Reize, wie onkogenen Stress (Onkogeninduzierte Seneszenz, OIS), DNA-Schäden, zytotoxische Medikamente oder Bestrahlung (stressinduzierte Seneszenz, SIS) induziert werden können. , 5 , 6. Als Reaktion auf DNA-Schäden, einschließlich Telomererosion, seneszen die Zellen entweder, beginnen unkontrolliertes Zellwachstum oder erleiden Apoptose, wenn der Schaden nicht repariert werden kann. In diesem Fall scheint die Zellseneszenz vorteilhaft zu sein, da sie tumorsuppressiv wirkt2. Im Gegensatz dazu wird die Seneszenz mit dem Altern aufgrund der Anhäufung von Zellschäden einschließlich DNA-Schäden erhöht. Da seneszente Zellen Zytokine, Metalloproteinasen und Wachstumsfaktoren, die als seneszenzassoziierter sekretomlischer Phänotyp (SASP) bezeichnet werden, sezernieren können, trägt diese altersabhängige Zunahme der zellulären Seneszenz und SASP zu einer verminderten Gewebehomöostase und später altern. Auch ist diese altersabhängige Erhöhung der Seneszenzbelastung bekannt, um Stoffwechselerkrankungen, Stressempfindlichkeit, Progerie-Syndrome und beeinträchtigte Heilung7,8 zu induzieren und ist zum Teil verantwortlich für die zahlreichen altersbedingten Krankheiten wie Arteriosklerose, Arthrose, Muskeldegeneration, Geschwürbildung und Alzheimer-Krankheit9,10,11,12,13. Die Beseitigung seneszierender Zellen kann helfen, Gewebefunktionsstörungen zu verhindern oder zu verzögern und die Gesundheitsspanne14zu verlängern. Dies wurde in transgenen Mausmodellen14,15,16 sowie durch die Verwendung von senolytischen Medikamenten und Arzneimittelkombinationen gezeigt, die sowohl durch Arzneimittelscreenings als auch durch bioinformatische Analyse von Wege, die speziell in seneszierenden Zellen induziert werden17,18,19,20,21,22. Die Identifizierung optimaler senotherapeutischer Medikamente, die in der Lage sind, die seneszente Zellbelastung effektiver zu reduzieren, ist ein wichtiger nächster Schritt bei der Entwicklung von therapeutischen Ansätzen für ein gesundes Altern.
Seneszenzzellen weisen charakteristische phänotypische und molekulare Merkmale auf, sowohl in der Kultur als auch in vivo. Diese Seneszenzmarker können entweder die Ursache oder das Ergebnis der Seneszenzinduktion oder ein Nebenprodukt molekularer Veränderungen in diesen Zellen sein. Es wird jedoch kein einzelner Marker speziell in seneszierenden Zellen gefunden. Derzeit ist der Seneszenz-assoziierte Nachweis von Seneszenz-assoziierten ‘-Galactosidase (SA—Gal) eine der am besten charakterisierten und etablierten einzelzellbasierten Methoden zur Messung der Seneszenz in vitro und in vivo. SA-A-Gal ist eine lysosomale Hydrolase mit einer optimalen enzymatischen Aktivität bei pH 4. Die Messung der Aktivität am pH 6 ist möglich, da seneszentiver Zellen eine erhöhte lysosomale Aktivität zeigen23,24. Bei lebenden Zellen wird eine erhöhte lysosomale pH-Wert-Taste durch lysosomale Alkalinisierung mit dem Vacuolar H+-ATPase-Inhibitor Bafilomycin A1 oder dem endosomalen Versauerungsinhibitor Chloroquin25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di–D-Galactopyranosid (C12FDG) wird als Substrat in lebenden Zellen verwendet, da es das geballte Produkt in den Zellen aufgrund seiner 12 Kohlenstoff lipophilen Moiety25behält. Wichtig ist, dass die SA—Gal-Aktivität selbst nicht direkt mit einem in seneszenten Zellen identifizierten Pfad verbunden ist und nicht notwendig ist, um Seneszenz zu induzieren. Mit diesem Test können seneszente Zellen auch in den heterogenen Zellpopulationen und alternden Geweben identifiziert werden, wie Hautbiopsien von älteren Menschen. Es wurde auch verwendet, um eine Korrelation zwischen Zellseneszenz und Alterung23 zu zeigen, da es ein zuverlässiger Marker für seneszente Zelldetektion in mehreren Organismen und Bedingungenist 27,28,29, 30. Hier wird ein sA–Gal-Screening-Assay mit hohem Durchsatz auf Basis des fluoreszierenden Substrats C12FDG mit primären embryonalen Fibroblasten (MEFs) mit robust oxidativer Stressinduzierter Zellseneszenz beschrieben und seine Vor- und Nachteile werden diskutiert. Obwohl dieser Test mit verschiedenen Zelltypen durchgeführt werden kann, ermöglicht die Verwendung von Ercc1-mangelhaften, DNA-Reparatur beeinträchtigten MEFs eine schnellere Induktion der Seneszenz unter Bedingungen von oxidativem Stress. Bei Mäusen verursacht eine reduzierte Expression der DNA-Reparatur-Endonuklease ERCC1-XPF eine beeinträchtigte DNA-Reparatur, beschleunigte Anhäufung von endogenen DNA-Schäden, erhöhte ROS, mitochondriale Dysfunktion, erhöhte seneszente Zellbelastung, Verlust der Stammzellfunktion und vorzeitige Alterung, ähnlich wie natürliche Alterung31,32. In ähnlicher Weise werden Ercc1-mangelhafte MEFs in Kultur17schneller sensithenz. Ein wichtiges Merkmal des seneszenten MEF-Assays ist, dass jeder Brunnen eine Mischung aus seneszenten und nicht-seneszenten Zellen hat, was eine klare Demonstration von seneszenten zellspezifischen Wirkungen ermöglicht. Obwohl wir glauben, dass die Verwendung von oxidativem Stress in Primärzellen, um Seneszenz zu induzieren, eher physiologisch ist, kann dieser Assay auch mit Zelllinien verwendet werden, bei denen Seneszenz mit DNA-schädlichen Mitteln wie Etoposid oder Bestrahlung induziert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-A-Gal ist ein klar definierter Biomarker für zelluläre Seneszenz, der ursprünglich von Dimri et al. entdeckt wurde. (1995) zeigt, dass seneszente menschliche Fibroblasten eine erhöhte Aktivität von SA-A-Gal haben, wenn sie bei pH 623 im Vergleich zu sich ausbreitenden Zellen gemessen werden. Inzwischen wurden In-vitro- und In-vivo-Assay für SA-A-Gal für verschiedene Zelltypen und Gewebe25,39,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der NIH Grants AG043376 (Projekt 2 und Core A, PDR; Projekt 1 und Core B, LJN) und AG056278 (Projekt 3 und Kern A, PDR; und Projekt 2, LJN) und ein Stipendium der Glenn Foundation (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
