SA-β-Galactosidase القائم على فحص الفحص لتحديد الأدوية Senotherapeutic
Summary
الحساسية الخلوية هي العامل الرئيسي في تطوير الأمراض المزمنة المرتبطة بالعمر. تحديد العلاجات التي تستهدف الخلايا المعمرة تظهر الوعد لتمديد الشيخوخة الصحية. هنا، نقدم اختبار جديد لفحص لتحديد senotherapeutics على أساس قياس الحساسية المرتبطة بيتا-Galactosidase النشاط في خلايا واحدة.
Abstract
الحساسية الخلية هي واحدة من السمات المميزة للشيخوخة المعروفة للتأثير سلبا على عمر صحي. الأدوية القادرة على قتل الخلايا المعمرة على وجه التحديد في ثقافة الخلايا، وتسمى senolytics، يمكن أن تقلل من عبء الخلايا المعمرة في الجسم الحي وتوسيع healthspan. وقد تم تحديد فئات متعددة من senolytics حتى الآن بما في ذلك مثبطات HSP90، مثبطات الأسرة BCL-2، piperlongumine، الببتيد مثبطة FOXO4 ومزيج من Dasatinib / Quercetin. الكشف عن SA-β-Gal في زيادة درجة الحموضة الليسوسومال هي واحدة من أفضل علامات تتميز للكشف عن الخلايا المعمرة. قياسات الخلايا الحية من senescence المرتبطة β-galactosidase (SA-β-Gal) النشاط باستخدام الركيزة الفلورسنت C12FDG في تركيبة مع تحديد رقم الخلية الإجمالي باستخدام الحمض النووي intercalating صبغ Hoechst يفتح إمكانية فحص الأدوية السيكوائية التي إما تقلل من النشاط الكلي SA-β-Gal عن طريق قتل الخلايا السينسنية (senolytics) أو عن طريق قمع SA-β-Gal وغيرها من الأنماط الظاهرية للخلايا السينسية (senomorphics). استخدام منصة عالية المحتوى الفلورسنت الحصول على الصور وتحليل يسمح لفحص سريع وعالية الإنتاجية من مكتبات المخدرات للآثار على SA-β-غال، مورفولوجيا الخلية ورقم الخلية.
Introduction
وصفت الحساسية الخلوية للمرة الأولى من قبل ليونارد هايفليك وبول مورهيد، الذي أظهر أن الخلايا الطبيعية لديها قدرة محدودة على الانتشار في الثقافة1. الخلايا السينسنتة تفشل في الانتشار على الرغم من وجود المواد الغذائية, عوامل النمو وعدم وجود تثبيط الاتصال, ولكن لا تزال نشطة التمثيل الغذائي2. وتعرف هذه الظاهرة باسم الحساسية المستنسخة ويعزى أساسا إلى تقصير التيلومير، على الأقل في الخلايا البشرية3. وقد أظهرت دراسات أخرى أن الخلايا يمكن أيضا أن تدفع إلى الخضوع للتخفيف استجابة لمحفزات أخرى، مثل الإجهاد الأنيكونوجيني (الأنكوجينية الناجمة عن الحساسية، OIS)، تلف الحمض النووي، والأدوية السامة للخلايا، أو التشعيع (الإجهاد الناجم عن الحساسية، SIS)4 , 5 , 6.ردا على تلف الحمض النووي، بما في ذلك تآكل التيلومير، والخلايا إما senesce، بدء نمو الخلايا غير المنضبط، أو الخضوع لالمبرمج إذا كان الضرر لا يمكن إصلاحه. في هذه الحالة ، يبدو أن الحساسية الخلوية مفيدة لأنها تعمل بطريقة قمعية للورم2. في المقابل، يتم زيادة الحساسية مع الشيخوخة بسبب تراكم الضرر الخلوي بما في ذلك تلف الحمض النووي. منذ الخلايا senescent يمكن أن تفرز السيتوكينات، metalloproteinases وعوامل النمو، ودعا النمط الظاهري الذي يرتبط بالحساسية (SASP)، وهذه الزيادة المعتمدة على العمر في الحساسية الخلوية وSASP يساهم في انخفاض الأنسجة التوازن و الشيخوخة في وقت لاحق. أيضا، ومن المعروف أن هذه الزيادة التي تعتمد على العمر في عبء الحساسية للحث على الأمراض الأيضية، وحساسية الإجهاد، ومتلازمات البروجريا، وضعف الشفاء7،8، وهو، في جزء منه، المسؤول عن العديد من العمر ذات الصلة الأمراض، مثل تصلب الشرايين، هشاشة العظام، انحطاط العضلات، تشكيل قرحة، ومرض الزهايمر9،10،11،12،13. القضاء على الخلايا المعمرة يمكن أن تساعد على منع أو تأخير خلل في الأنسجة وتمديد healthspan14. وقد تبين ذلك في نماذج الماوس المعدلة وراثيا14،15،16 وكذلك باستخدام الأدوية وتركيبات المخدرات التي تم اكتشافها من خلال كل من جهود فحص المخدرات وتحليل المعلوماتية الحيوية مسارات المستحثة على وجه التحديد في الخلايا السينسنت17،18،19،20،21،22. تحديد الأدوية العلاجية السيزوية المثلى، قادرة على الحد بشكل أكثر فعالية من عبء الخلايا المعمرة، هو خطوة هامة تالية في تطوير النهج العلاجية للشيخوخة الصحية.
تظهر الخلايا السينسية السمات الفينوتية والجزيئية المميزة، سواء في الثقافة أو في الجسم الحي. يمكن أن تكون علامات الحساسية هذه إما السبب أو نتيجة للتحريض الحساسية أو منتج ثانوي للتغيرات الجزيئية في هذه الخلايا. ومع ذلك، لم يتم العثور على علامة واحدة على وجه التحديد في الخلايا المعمرة. حاليا، المرتبطة بالحساسية β-galactosidase (SA-β-Gal) الكشف هو واحد من أفضل الأساليب ذات طابع وأنشئت على أساس خلية واحدة لقياس الحساسية في المختبر وفي الجسم الحي. SA-β-Gal هو هيدرولاس ليسوسومال مع النشاط الأنزيمي الأمثل في درجة الحموضة 4. قياس نشاطها في درجة الحموضة 6 ممكن لأن الخلايا المعمرة تظهر زيادة النشاط الليسوسومال23،24. بالنسبة للخلايا الحية ، يتم الحصول على زيادة درجة الحموضة اللايسومال عن طريق القلوية الليسوسومال مع مثبطات الفراغات H+-ATPase مثبطات بافيلوميسين A1 أو مثبطات التحمض الاندوسيومال الكلوروكين25،26. 5-Dodecanoylaminofluoressin Di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) يستخدم كالركيزة في الخلايا الحية كما أنه يحتفظ المنتج المخطوف في الخلايا بسبب 12 الكربون lipophilic moiety25. الأهم من ذلك، لا يرتبط نشاط SA-β-Gal نفسه مباشرة مع أي مسار محدد في الخلايا المعمرة وليس من الضروري للحث على الحساسية. مع هذا الفحص، يمكن تحديد الخلايا المعمرة حتى في مجموعات الخلايا غير المتجانسة والأنسجة القديمة، مثل الخزعات الجلدية من الأفراد الأكبر سنا. كما تم استخدامه لإظهار وجود علاقة بين الحساسية الخلية والشيخوخة23 كما هو علامة موثوق بها للكشف عن الخلايا senescent في العديد من الكائنات والظروف27،28،29، 30. هنا، يتم وصف اختبار فحص SA-β-Gal عالي الإنتاجية استنادًا إلى الركيزة الفلورية C12FDG باستخدام الخلايا الليفية الجنينية الأولية للماوس (MEFs) مع شدة الأكسدة الناجمة عن الإجهاد والحساسية ومزاياه وعيوبه يتم مناقشتها. على الرغم من أن هذا الفحص يمكن أن يتم مع أنواع الخلايا المختلفة، واستخدام Ercc1نقص، وإصلاح الحمض النووي ضعف MEFs يسمح لتحريض أسرع من الحساسية في ظل ظروف الإجهاد التأكسدي. في الفئران، وانخفاض التعبير عن إصلاح الحمض النووي endonuclease ERCC1-XPF يسبب ضعف إصلاح الحمض النووي، والتراكم المتسارع لتلف الحمض النووي المحلي، وارتفاع ROS، الخلل الميتوكوندريا، وزيادة عبء الخلايا المعمرة، وفقدان وظيفة الخلايا الجذعية و الشيخوخة المبكرة، على غرار الشيخوخة الطبيعية31،32. وبالمثل، Ercc1-نقصMEFs الخضوع للسرعة أكبر في الثقافة17. ومن السمات الهامة لـ “الـ MEF” المناوئ ة أن كل بئر لديها خليط من الخلايا المعمرة وغير السينية، مما يسمح بإظهار واضح للآثار الخاصة بالخلايا. ومع ذلك، على الرغم من أننا نعتقد أن استخدام الإجهاد التأكسدي في الخلايا الأولية للحث على الحساسية هو أكثر فيزيولوجيا، وهذا الفحص يمكن أيضا أن تستخدم مع خطوط الخلايا حيث يتم حث الحساسية مع العوامل الضارة الحمض النووي مثل etoposide أو التشعيع.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-Gal هو علامة حيوية محددة جيدا للوسن الخلوي ة التي اكتشفها في الأصل ديميري وآخرون. (1995) تبين أن الخلايا الليفية البشرية المعطرة قد زادت من نشاط SA-β-Gal عند اختبارها في درجة الحموضة 623 مقارنة بالخلايا المتكاثرة. وفي الوقت نفسه، في المختبر وفي الجسم الحي اتسياسي لSA-β-غال وقد أ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة المنح AG043376 (المشروع 2 والأساسية A، PDR; المشروع 1 وCore B, LJN) and AG056278 (Project 3 and Core A, PDR; and Project 2, LJN) وa grant from the Glen Foundation (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
