Luminofor är placerad delen Formation i olika konformationer av bovint Serum Albumin genom bindning av Gold(III)

Summary

Protokollen för att studera bindningen av guld katjoner (Au(III)) till olika konformationer av bovint serumalbumin (BSA) som liksom för att karaktärisera den konfirmerande beroende unika BSA-Au fluorescensen presenteras.

Abstract

Syftet med protokoll som presenteras är att studera processen för Au(III) bindning till BSA, ger konformation förändring-inducerad röd fluorescens (λ_em = 640 nm) av BSA-Au(III) komplex. Metoden justerar pH för att visa att uppkomsten av den röda fluorescensen är korrelerad med de pH-inducerad jämvikt övergångarna av de BSA konformationer. Röd fluorescerande BSA-Au(III) komplex kan endast bildas med en justering av pH vid eller över 9.7, vilket motsvarar ”A-formulär” konformation av BSA. I protokollet att justera BSA att Au molar förhållandet och övervaka tid-processen för Au(III) bindande beskrivs. Det minsta antalet Au(III) per BSA, att producera den röd fluorescensen, är mindre än sju. Vi beskriver steg för att illustrera förekomsten av flera Au(III) bindningsställen i BSA protokoll. Första, genom att lägga till koppar (Cu(II)) eller nickel (Ni(II)) kationer följt av Au(III), denna metod avslöjar ett bindningsställe för Au(III) som inte är röda fluorophore. För det andra, genom att ändra BSA thiol tak agenter, en annan nonfluorophore-bildar Au(III) bindningsställe avslöjas. För det tredje, ändra BSA konformation genom klyva och tak av disulfide obligationer, möjliga Au(III) bindande industriområden är illustrerade. Protokollet beskrivs, för att kontrollera BSA konformationer och Au(III) bindande, kan tillämpas allmänt för att studera samspelet mellan andra proteiner och metall katjoner.

Introduction

En BSA-Au förening uppvisar en ultraviolett (UV)-retbara röd fluorescens, med anmärkningsvärd stokes Skift, ursprungligen har syntetiserats av Xie et al. ¹. den unika och stabil röd fluorescensen kan hitta olika applikationer inom bland annat avkänning^2,3,4, imaging^5,6,7eller nanomedicin^{8 ,9,10,11,12,13}. Denna förening har studerats ingående av många forskare inom nanovetenskap i senaste åren^14,15,16. BSA-Au föreningen har tolkats som Au₂₅ nanoclusters. Målet med denna metod är att undersöka denna förening i detalj och att förstå ursprunget till den röd fluorescensen. Genom att följa metoden presenteras, kan förekomsten av flera Au bindande platser, och ursprunget till fluorescens, alternativ till den enda plats kärnbildning av Au₂₅ nanoclusters, illustreras. Samma tillvägagångssätt kan användas för att studera hur andra proteiner^17,18,19 komplex med Au(III) kan ändra sina inneboende fluorescerande egenskaper.

Syntesen av röd fluorescerande BSA-Au föreningen kräver en smala kontroll av molar förhållandena av BSA att Au (BSA:Au) att maximera intensiteten av fluorescensen och placeringen av topparna i excitation-utsläpp karta (EEM)²⁰. Det kan visas att det finns flera bindningsställen för Au(III) att binda, inklusive asparagin fragment (eller Asp fragment, de fyra första aminosyra resterna vid N-terminalen av BSA)^21,22. De 34^th aminosyran i BSA (Cys-34) visas också att samordna Au(III) och deltar i mekanismen av den röda fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))²⁰. Klyva alla Cys-Cys disulfide obligationer och tak alla tioler, röd fluorescens är inte producerade ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Detta indikerar behovet av Cys-Cys disulfide obligationer som webbplatsen Au(III) bindande för att producera den röd fluorescensen.

Protein kemi tekniker har inte använts att studera de BSA-Au(III) komplex i nano-science gemenskapen. Dock skulle det vara värdefullt att anställa dessa tekniker för att förstå vissa aspekter av dessa komplex, samt för att få detaljerad förståelse för de Au(III) bindningsställen i BSA. Denna artikel är avsedd att visa några av dessa tekniker.

Protocol

1. Sammanfattning av BSA-Au(III) komplex Lös upp 25 mg av BSA i 1 mL högpresterande vätskekromatografi (HPLC) grade vatten i en 5 mL injektionsflaska av reaktion.Obs: Lösningen ska visas tydligt. Lös upp guld (III) klorid trihydrate (chloroauric syra) till en koncentration av 5 mM i vatten av HPLC-kvalitet.Obs: Lösningen bör visas gula. Chloroauric syra lösning som beretts vid denna koncentration kommer att resultera i en BSA Au-förhållandet 1:13. Alternativt kan bereda en l?…

Representative Results

Från fluorescensen av BSA-Au(III) komplex, har det observerats att omvandlingen av den inneboende blå fluorescensen av BSA (λem = 400 nm) till röd fluorescens (λem = 640 nm) inträffar vid ungefär pH 9,7 genom en equilibrium övergång (figur 1). EEM av BSA-Au(III) på olika BSA till Au molar nyckeltal visas i figur 2, och dessa data visar hur förändra molar förhållandet ger samma…

Discussion

De BSA-Au(III) föreningarna beredd vid pH 12 uppvisar röd fluorescens på emissionsvåglängden λ_em= 640 nm när glada med ultraviolett (UV) ljus λ_ex= 365 nm (figur 1A). Uppkomsten av röd fluorescens är en långsam process och tar ett par dagar i rumstemperatur att öka till en maximal intensitet. Kör reaktionen vid 37 ° C kommer att ge de optimala resultat, även om högre temperatur kan användas för att producera den röd fluorescensen snabbare. Irr…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999%	Sigma-Aldrich	459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0%	Sigma-Aldrich	4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0%	Sigma-Aldrich	C4706
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Urea, 99.5%	Chem-Implex Int'l	30142
Phospate buffered saline (PBS)	Corning	MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830